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一种氯霉素高灵敏消线法检测试纸条的制备

2021-08-20 23:08:20 来源:

　　一种氯霉素高灵敏消线法检测试纸条的制备
　　宁军1，李 娜 2、严雨倩2，付 麟2，周兴华2
　　（1.广东精捷检验检测有限公司，广东云浮 527400;2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）
　　摘 要∶本文对氯霉素进行丁二酸酐衍生得到半抗原，将半抗原与载体蛋白 BSA偶联作为免疫原，氯霉素与偶连载体蛋白 0VA作为筛选抗原，获得氯霉素单克隆抗体，IC。值为0.010 6 ng/mL，线性范围为 0.002 3～0.0495 ng/mL，特异性好，与相关药物没有交叉。在此抗原抗体的基础上制备胶体金试纸条，对鸡肉样本进行添加回收试验，消线法检测限为0.1μg/kg，与目前市场上主流的比色法判读试纸条相比，消线法判读更加快速，不需要使用读数仪辅助判读，为农产品质量安全提供有力保障。
　　关键词∶氯霉素;单克隆抗体;胶体金免疫层析试纸条;消线法;检测
　　氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是一种广谱抗生素，对 革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用。长期食用含有 氯霉素的鸡肉组织会扰乱人体正常的生理功能，引起再生障 碍性贫血。农业部第250号公告中明确规定氯霉素及其盐、 酯在动物性食品中禁止使用，所以测定动物组织中氯霉素残 留含量具有重要的意义。目前动物性食品中氯霉素残留检测 方法有免疫分析方法、质谱法等。免疫学方法是农产品中抗 生素残留检测中最重要的检测技术之一，具有成本低、操作 简便、快速等优点，不需要辅助仪器，更适合大量样本的初 筛检测。目前市场上的氯霉素试纸条，灵敏度不够高，基本 上都是釆用比色判读方法，试纸条上控制线和检测线差异不 大，判读结果争议较大。本研究制备的氯霉素试纸条，灵敏 度高，可以釆用消线法判读，判读更加快速、准确，为农产 品质量安全提供有力保障『％
　　1材料与方法
　　1.1试剂与药品
　　氯霉素标准品，购买自百灵威科技有限公司；牛血清白 蛋白(BSA)、水溶性碳二亚胺盐酸盐(EDC HCL)、N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)、3,3',5,5，-四甲基联苯胺(TMB)、 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚乙二醇溶液(50% PEG solution(w/v))、辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗、 羊抗鼠抗体IgG购买自武汉博士德公司；新西兰胎牛血清， 细胞基础培养液RPMI 1640,选择性培养基HAT(50x)、 HT(100x),购买自Gibco公司；胶体金试纸条底板(PVC 材质)，硝酸纤维素膜(NC膜)，吸水垫和样品垫均购买 自Goldbio科技有限公司；其他实验室常用试剂均为国产分 析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司；阴性鸡肉样本 由温氏集团检测中心提供。
　　1.2仪器与设备
　　台式高速(冷冻)离心机，湘仪仪器；高压蒸汽灭菌锅 (MLS-375 1L-PC),松下健康医疗器械株式会社；磁力搅 拌器(Big Squid),德国IKA；纯水机(20 TB),赛飞(中国) 有限公司；液氮罐，成都金凤液氮容器有限公司；酶标仪、 3111型加水套CO2培养箱、紫外-可见分光光度计Biomate 3S, Thermo Fisher Sciencetific 公司洁净工作台(BCM-1300A), 苏净安泰空气技术有限公司；数显恒温水浴锅(HH-2),江 苏金怡仪器科技有限公司；倒置显微镜(XD-202),南京江 南永新光学有限公司；金标滑膜仪、切条机，上海金标生物 科技有限公司。
　　1.3实验动物和细胞
　　实验动物：SPF级BALB/c小鼠，6 ~ 8周龄，雌性， 扬州大学医学中心；实验细胞：SP 2/0细胞，中国科学院上 海生命科学研究院。
　　1.4试验方法
　　1.4.1半抗原衍生
　　氯霉素分子表面有两个自由羟基，一个伯羟基，一个仲 羟基。伯羟基可以与丁二酸酊反应生成梭酸，可与蛋白偶连。 5.5 mg氯霉素溶解于0.5mLtt®中，加入4.2mgDMAP 与2 mg 丁二酸酊，50P磁力搅拌反应4h,得到衍生产物 CAP-COOH.将反应产物氮吹干，溶解于水中并使用二氯 甲烷萃取2次，将二氯甲烷相合并，氮气吹干，得到目标产 物旷71。衍生步骤如图1所示。
　　1.4.2完全抗原的合成
　　（1） 免疫原合成方法。2 mg的CAP-COOH半抗原溶解 于400 hL DMF溶液中，加入1.1 mg NHS与1.8 mg碳二亚 胺EDC,室温条件下磁力搅拌反应2 h,得到活性酯。随后 将活性酯逐滴加到5 mg BSA溶液中，室温磁力搅拌过夜。 将最终产物装入透析袋中，在0.05 mol/L PBS溶液中透析 3d,每4〜8h更换一次透析液。透析结束后分装小份， -20 °C保存[8_10]o
　　（2） 包被原合成方法。氯霉素上游离的羟基通过CDI法 与蛋白偶联，3 mg CAP溶解于0.5 mL无水DMSO试剂中， 加入2mgCDL室温磁力搅拌反应20 min。向反应液中加 入100 uL超纯水终止反应。随后将活化产物逐滴加到5 mg OVA蛋白溶液，室温条件下磁力搅拌反应4 h。偶联产物在 0.05 mol/L PBS溶液中透析3d,每4〜8h更换一次透析 液凹。透析结束后分装小份，-20 P保存。
　　1.4.3小鼠免疫及血清筛选
　　使用合成的完全抗原CAP-COOH-EDC-BSA作为免疫 原进行小鼠免疫实验，CAP-CDI-OVA作为包被原进行筛选 实验。每个免疫原选取4 H BALB/c小鼠进行免疫。釆用间 接竞争ELISA方法[12-13]测定小鼠血清效价与抑制效果，具 体步骤如下。
　　（1） 包板。用包被缓冲液将包被原（CAP-CDI-OVA）稀释 到适宜浓度，加入到96孔酶标板（100 J1L/孔）中，37。（2下 孵育2h。孵育结束后甩出酶标板中液体，加入洗涤缓冲液 （含 0.05% 吐温 20 的 0.01 mol/L PBS, 200 gL/ 孔），静止 3 min后甩出，拍干，重复洗涤3次，拍干。
　　（2） 封闭。每孔中加入200 gL封闭液，4。（3过夜，洗涤 液改为250pL洗涤3次，拍干。
　　（3） -抗。使用棋盘法同时测定小鼠的血清效价与抑 制。使用洗涤缓冲液作为阴性对照（50 nL/孔）,检测组加 入适宜浓度的标准品溶液（50 jxL/孔）。处理好的小鼠血清从 1 000倍用抗体稀释液进行梯度稀释（1 000> 3 000> 9 000> 27 000倍），分别对应加入对照组与检测组中，37P下孵 育30tnm,洗涤3次同上，拍干。
　　（4） 二抗。将HRP二抗用洗涤缓冲液稀释3 000倍，然 后每孔加入100 gL,37 °C下反应30 min,洗涤3次同上，拍干。
　　（5） 显色。使用前将A液与B液按1 ： 1配制，混匀后 加入酶标板（100 pL/孔）,37 °C下避光显色15 min。
　　（6） 终止。酶标板中每孔加入50 nL终止液，使用酶标 仪测量450 nm、620 nm下吸光值，最终结果按照OD颂皿- OD620mn保存数据。
　　1.4.4细胞融合及抗体制备
　　筛选效果较好的小鼠进行细胞融合试验。①SP 2/0细胞 的复苏与扩大培养；②小鼠脾脏细胞融合。小鼠脾细胞与 SP2/0细胞混合均匀，比例为5 : 1,釆用PEG 1500进行 细胞融合试验；③杂交瘤细胞的培养与筛选。细胞融合后第 7 d进行细胞上清检测，挑选OD值高，抑制率高的孔进行 亚克隆，使用有限稀释法进行3次亚克隆，挑选出单团杂交 瘤细胞转移至培养瓶中进行扩大培养，最后转移至液氮储存 箱中保存叫
　　釆取体内诱生腹水瘤法制备细胞株腹水抗体，再使用辛 酸-硫酸铉法进行抗体纯化[11]=
　　1.4.5单克隆抗体的评价
　　釆用间接竞争法，分别测定所制备单克隆抗体对氯霉素 与其结构类似物（氟苯尼考、甲砚霉素）的值。交叉反 应率（Cross-reactivity, CR, %）=（氯霉素 /C50 值 / 类似物
　　值）xi00%[6113]o
　　1.4.6胶体金试纸条的制备
　　按照柠檬酸三钠还原法制备金纳米粒子，釆用O.lmol/L 碳酸钾溶液进行抗体标记，标记量分别为6 pg/mL、8 gg/mL, 10 p.g/mL 和 12 pg/mL, 10% BSA 封闭，0.01 mol/L pH 8.5 硼酸缓冲液（含0.25% BSA, 3%海藻糖，1%吐温20）复溶， 按照50 nL每孔加入到微孔板中，冻干，密封保存。
　　试纸条主要由PVC底板，NC膜，样品垫和吸水纸组成。 将羊抗鼠抗体（靠吸水纸端）和抗原（靠样品垫端）按照一定的 浓度划到硝酸纤维膜上，分别构成试纸条质控线（C线）和检 测线（T线）,随后将试纸条在37P下烘箱中烘干过夜us， 在靠近C端贴上吸水纸，靠近T线端贴好样品垫。切成4 mm 宽度。检测时，将待检测液体加入微孔中，反应3 min后， 插入试纸条，5mhi后判读。
　　1.4.7添加回收试验
　　对鸡肉阴性样本进行氯霉素添加回收试验。阴性对照组 添加不含标准品空白溶剂作为对照。具体操作如下：取4g 均质后的样品，添标浓度分别为0、0.05 pg/kg、0.10 gg/kg 和0.20 gg/kg,加入7 mL乙酸乙酯，剧烈振荡5 min, 4 000转离心5 min。取4mL上清，氮气65。（3吹干后，再 加入2 mL正己烷和0.4 mL 0.01 mol/L PBS,振荡1 min,离 心3 min,去除上层，取下层溶液100 gL点样。
　　2结果与分析
　　2.1完全抗原的合成与表征
　　氯霉素半抗原、载体蛋白（BSA和OVA）及合成的免疫 抗原和包被抗原分别使用0.01 moVL PBS稀释至合适的浓 度，使用紫外-可见分光光度计在200〜450 nm范围内进 行扫描，结果如图2所示。
　　如图2所示，两种载体蛋白的紫外特征峰均位于278 nm 左右，偶联物CAP-COOH-EDC-BSA紫外吸收较同浓度的 BSA有明显增强且有略微偏移。同样，偶联物CAP-CDI- OVA紫外吸收较同浓度OVA也有明显增强，紫外表征结果 显示氯霉素半抗原成功的与载体蛋白进行了偶联。
　　2.2单克隆抗体的评价
　　通过对小鼠血清进行ELISA检测，筛选效价高、抑制 率高的小鼠进行细胞融合实验。通过阳性筛选与3次亚克隆, 得到针对氯霉素的杂交瘤细胞株（6E2）,并制取腹水，纯 化后得到氯霉素单克隆抗体[11]
　　釆用棋盘法，筛选出氯霉素单克隆抗体的最佳工作点， 即包被浓度0.03卩g/mL、抗体浓度0.25卩g/mL,然后以不同 浓度的氯霉素标准品溶液(0、0.003 ng/mL、0.010 ng/mL、 0.030 ng/mL、0.090 ng/mL 和 0.270 ng/mL)建立标准曲线， 其标准曲线如图3所示，其云爲值为0.010 6 ng/mL,线性 范围CIG。〜IC80)为0.002 3〜0.049 5 ng/mL,相关系数 为 0.999 Oo
　　通过ic-ELISA方法测定氯霉素单克隆抗体的交叉反应， 检测结果如表1所示，氯霉素单克隆抗体具有特异性，对氟 苯尼考和甲飒霉素交叉均在1%以下。
　　2.3胶体金试纸条的制备
　　使用不同包被浓度和抗体标记量进行试验，确定最优条 件C线划膜浓度为0.5 mg/mL、T线划膜浓度为0.2 ing/mL 和抗体标记量为10|ig/mL。如图4所示，使用肉眼观察时， 氯霉素金标试纸条消线值为0.1卩g/kg。
　　2.4实际样本添加回收试验
　　采用以上前处理方法，使用阴性样品添加试验确定该 方法灵敏度。4种阴性鸡肉样品氯霉素添加水平为0、0.05g/kg、0.10μg/kg、0.20 μg/kg。结果如图5所示，使用肉
　　眼观察时，氯霉素消线法的检测限为0.1 μg/kg。
　　3 结论
　　本文采用一种完全抗原对小鼠进行免疫，成功制备了一种氯霉素单克隆抗体，ICso值为0.0106ng/mL,特异性好，与相关药物没有交叉。在此抗原抗体的基础上制备胶体金试纸条，对鸡肉组织样本做了添加回收试验，消线法检测限为0.1 μg/kg,该方法成本低、灵敏度好、操作方便快速，判读方式简单，对鸡肉中氯霉素残留的监控有重要意义。
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