双剑客！纳米载体与细胞治疗共击癌症

纳米载体.联合用药.细胞治疗
随着今年八月诺华CAR-T细胞治疗商品Kymriah™静脉输注悬浮液获FDA批准上市，作为一种新型的细胞免疫疗法，利用患者自身免疫细胞对抗癌症，已为我们开启了一个全新抗癌新篇章。利用细胞治疗方法，对抗更多种类的肿瘤，包括实体瘤，如神经胶质瘤，是当前肿瘤免疫治疗的热点。目前CAR-T细胞治疗，也存在不少瓶颈难题，如缺少肿瘤特异性靶点、on-target/off-tumor副作用、通用差和生产制备成本高等问题，而纳米载体可通过“特洛伊木马”效应，联合其他治疗手段，改善细胞治疗中遇到的瓶颈难题。

案例一 中性粒细胞介导化疗药物抑制恶性脑胶质瘤术后复发
脑胶质瘤是颅内最常见的恶性侵袭性生长肿瘤，临床治疗常采用手术结合放/化疗的方法。一线脑胶质瘤化疗药物替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）可透过血脑屏障，但术后治疗效果并不尽人意。而其他抗肿瘤药物，如紫杉醇等，则因难以透过血脑屏障而不能应用于脑胶质瘤临床治疗。
2017年中国药科大学张灿教授课题组在Nature Nanotechnology杂志（影响因子38.986）上发表论文，借助脂质体纳米载体，使用中性粒细胞治疗与化疗药物紫杉醇（Paclitaxel, PTX）联合治疗脑胶质瘤，实现了高效自主引导的药物靶向递送，对原位脑胶质瘤小鼠模型术后的复发起到显著抑制效果。
如上流程图所示，，将紫杉醇PTX在体外包裹形成PTX-CL阳离子脂质体，与从小鼠体内分离的中性粒细胞（Netrophils, NEs）孵育，中性粒细胞将PTX-CL吞噬胞内形成细胞制剂（PTX-CL/NEs）。通过尾经脉注射将细胞制剂注入原位脑胶质瘤术后小鼠模型体内，细胞制剂透过血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）到达脑胶质瘤区域。随后被肿瘤区内高浓度炎症因子激活，形成胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs），将细胞制剂内的紫杉醇脂质体从细胞内释放出来，被脑胶质瘤细胞摄取，从而发挥抗脑胶质瘤作用。
在3D胶质瘤细胞模型上，使用Cou6探针（绿色）标记脂质体纳米颗粒，通过共聚焦光学切片观察不同处理条件下的脂质体对3D细胞的浸润情况， Cou6-CL/NEs复合体组能更好的侵入3D肿瘤细胞微球内部（上图d）。在单层G422神经胶质瘤细胞模型上，通过Cou6探针（绿色）标记脂质体／DiR（紫色）标记中性粒细胞／Hoechst（蓝色）标记所有细胞核／PI（红色）标记死细胞，通过显微成像观察不同处理时间点，中性粒细胞释放NETs及对G422胶质瘤细胞的杀伤情况，随着时间的推移，8小时后中性粒细胞释放Cou6，且被G422细胞内吞后造成细胞死亡（上图e）。通过G422细胞存活实验进一步验证，PMA处理的细胞制剂（PTX-CL/NEs）与PTX-CL具有相当的肿瘤杀伤效果（上图f）

在G422细胞原位接种脑胶质瘤小鼠术后模型上，使用DiR染料标记PTX-CL/NEs，通过小动物活体成像，监测PTX-CL/NEs在不同组织内的实时分布情况，进一步分析发现PTX-CL/NEs能有效透过血脑屏障到达脑部神经胶质瘤病灶区（上图b/e）。从小鼠生存曲线来看，PTX-CL/NEs处理组与其他对照组相比能显著提高治疗效果（上图f），且与病理切片免疫组化结果完全一致（上图g）。

案例二 将CAR基因装入纳米载体，开启纳米CAR-T治疗新方案

CAR-T 细胞治疗过程复杂，需要分离提取T细胞—基因改造—体外培养—回输体内等流程，过程繁琐，存在多种安全隐患，且治疗成本昂贵。2017年Tyerl T. 等人在Nature Nanotechnology杂志上发表一种全新的纳米CAR-T细胞治疗新方案，该方法采用与传统体外构建的完全不同的策略，将CAR基因装入特殊纳米载体后，直接将纳米颗粒注入动物模型体内，纳米载体携带CAR基因靶向进入T细胞后，在体内自动完成CAR-T细胞构建及治疗。
这种全新的纳米载体设计非常巧妙，纳米颗粒内除了含有带有关键CAR基因和GFP/Luc标记的基因以外，还组装有高活性转位酶基因（iPB7），用于后期体内CAR-T细胞自主构建。同时在纳米颗粒外部，偶联有CD3eF(ab̒)2抗体（黄色）可靶向白血病特异性T细胞。另外与CAR基因偶联的GFP/luc（CBR-luc）双报告基因，方便对纳米载体在体内治疗效果进行实时追踪。

在白血病小鼠模型上，使用不同设计的纳米载体与传统体外组装的CAR-T细胞治疗同时进行治疗对比，使用活体成像系统对治疗效果进行长达84天的实时监测，发现含有P4-1BBz和iPB7基因的纳米载体，能特异识别T细胞并自动完成CAR组装，且与传统体外组装的CAR-T细胞治疗具有相同的治疗效果（上图a-b）。