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正交试验设计在优化酿酒酵母 培养条件中的应用

2018-06-27 09:44:27 来源: 金博宝188官网注册 导刊

　　摘要：本文以优化酿酒酵母培养条件为例，详细阐述了正交试验设计的应用过程，包括正交试验设计中的具体环节如：定指标、选因素、定水平、列因素水平表、选正交表等。具体采用了L9(33)正交表对影响酿酒酵母生长的关键因素：培养时间、培养温度和摇床转速进行了正交试验设计，同时详细阐述了如何对试验结果进行方差分析和极差分析。
　　关键词：正交试验设计；优化；培养条件；酿酒酵母
　　Abstract:In this paper,to optimize the culture conditions of Saccharomyces cerevisiae as an example,the application process of orthogonal experiment design is described in detail.The specific links of orthogonal experiment design are as follows:setting indicators,factoring,setting level,column factor table,choosing the orthogonal table and so on.Adopting the L9(33)orthogonal table on the growth of Saccharomyces cerevisiae including:the incubation time,the culture temperature and the rotational speed of the shaker were investigated by orthogonal test.At the same time,the variance analysis and the analysis of the results were analyzed in detail.
　　Key words:orthogonal experiment design;optimization;culture conditions;Saccharomyces cerevisiae.
　　酿酒酵母也称出芽酵母或面包酵母，为革兰氏染色阳性菌，单细胞，球形、椭圆形(3~8μm)或细胞延伸呈退化型假菌丝。近几年来，酿酒酵母作为模式生物在基因工程领域也发挥了较大作用，人们利用酿酒酵母生产大量的重组蛋白及生物药品，并取得一定的进展[1]。这些成果皆是以发酵获得高细胞浓度的酵母为基础进行研究而取得的，国内外对于酿酒酵母发酵领域的研究已有较多报道。
　　正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。正交试验在不影响试验效果的前提下，设计用较少的试验次数，取得较为准确、可靠的优选结论，大大提高了试验的效率。
　　本文将采用正交试验设计探讨在多因素多水平条件下如何优化酿酒酵母的培养条件，以期获得高细胞浓度的酵母。
　　1.正交试验方案设计
　　1.1指标
　　本实验以酿酒酵母菌液的吸光值（600 nm处）为指标，指标越大越好。指标越大，表明酿酒酵母液密度越大即酿酒酵母生长越好。
　　1．基金项目：本文系泸州职业技术学院院级课题《浓香型白酒发酵温度及发酵时间对杂醇油含量影响的初步研究》（项目编号：K-1718），川酒文化国际传播研究中心规划项目《互联网+川酒文化国际传播策略研究》（项目编号：CJCB2017-14）阶段性成果。
　　2．作者简介：潘玲玲（1988-），女，四川绵阳人，助教，硕士。主要研究方向食品工程与酿造科学。
　　1.2选因素
　　酿酒酵母培养的时间、温度和转速这3个因素对其细胞密度影响较大，因此选择这三个因素进行试验。
　　1.3定水平
　　单因素实验确定酿酒酵母生长的最佳培养时间、温度和转速。为了详细阐述我们假设单因素实验结果为最佳培养时间27h，最佳培养温度28℃，最佳转速为150(r/min)。同时依据单因素试验后数据分析，假设选定较优培养时间为25 h、27 h、29 h；较优培养温度为27℃、28℃、29℃；较优摇床转速为150r/min、160r/min、170 r/min。
　　1.4列因素水平表
　　酵母培养条件的正交实验设计以上文得出的较优数据为相应因素的三个水平，三因素即培养时间、培养温度、摇床转速，分别记作A、B、C，进行三因素三水平的正交试验，对培养条件进一步优化。因素水平表如表1所示。
　　表1
　　水平
　　因素培养时间/h
　　A培养温度/℃
　　B摇床转速
　　C/(r/min)
　　1 25 27 150
　　2 27 28 160
　　3 29 29 170
　　1.5选择合适的正交表
　　一般情况下，试验因素的水平数应等于正交表中的水平数；因素个数应不大于正交表的列数；各因素的自由度之和小于所选正交表的总自由度，以便估计试验误差。若各因素及交互作用的自由度之和等于所选正交表总自由度，则可采用有重复正交试验来估计试验误差[2]。
　　正交表选择依据：
　　列：正交表的列数c≥因素所占列数+交互作用所占列数+空列。
　　自由度：正交表的总自由度（a-1）≥因素自由度+交互作用自由度+误差自由度。
　　本试验有3个因素三个水平，且不考虑因素间的交互作用，依据以上原则，试验的次数应该为9次，故宜选用L9（33）正交表。
　　2.正交试验方案
　　按下列正交试验方案分别进行试验，记录试验结果（见表2）。为方便数据分析，正交试验结果假设为y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7、y8和y9。（本试验没有涉及交互作用）
　　3.试验结果分析（确定试验因素的优水平和最优水平组合）
　　3.1直观分析法---极差分析法
　　直观分析法对试验结果分析的优点是简单、直观、易做，计算量较少。
　　表2
　　试验号A B C试验结果
　　（OD600）
　　1 1 1 1 y1
　　2 1 2 2 y2
　　3 1 3 3 y3
　　4 2 1 2 y4
　　5 2 2 3 y5
　　6 2 3 1 y6
　　7 3 1 3 y7
　　8 3 2 1 y8
　　9 3 3 2 y9
　　K1j y1+y2+y3 y1+y4+y7 y1+y6+y8
　　K2j y4+y5+y6 y2+y5+y8 y2+y4+y9
　　K3j y7+y8+y9 y3+y6+y9 y3+y5+y7
　　k1j(y1+y2+y3)/3(y1+y4+y7)/3(y1+y6+y8)/3
　　k2j(y4+y5+y6)/3(y2+y5+y8)/3(y2+y4+y9)/3
　　k3j(y7+y8+y9)/3(y3+y6+y9)/3(y3+y5+y7)/3
　　R RA=kAmax-kAmin RB=kBmax-kBmin RC=kCmax-kCmin
　　优组合
　　第一步：算
　　Kij i表水平数，j表因素
　　K1A表示A因素第一个水平下试验值之和。
　　K2A表示A因素第二个水平下试验值之和。
　　K3A表示A因素第三个水平下试验值之和。
　　K为第j列因素i水平所对应的试验指标和，k为各水平所对应的平均值。由k大小可以判断第j列因素优水平和优组合。
　　即是：K1A=y1+y2+y3 K2A=y4+y5+y6 K3A=y7+y8+y9
　　k1A=K1A/3 k2A=K2A/3 k3A=K3A/3
　　同理可得：K1B、K2B、K3B、K1C、K2C、K3C
　　k1B、k2B、k3B、k1C、k2C、k3C
　　具体计算如表2所示。
　　第二步：比
　　同一列中，k值最大者减去最小者所得的差称为极差，极差计算公式：，具体计算如上表3所示。R为第j列因素的极差，反映了第j列因素水平波动时，试验指标的变动幅度。R越大，说明该因素对试验指标的影响越大，本试验中即是极差越大的，该因素对OD值的影响越大，反之越小。根据R大小，可以判断因素的主次顺序。假设本例中极差RA＞RC＞RB，则因素主次为A＞C＞B，则表明酿酒酵母的培养时间对OD值影响最大，摇床转速次之，培养温度影响最小。
　　第三步：看
　　首先找出各因素下最大的那个kij值，然后再比较这三个值，从而找出最优组合，假设本例中k3A＞k2A＞k1A，k2C＞k1C＞k3C，k2B＞k3B＞k1B且k3A＞k2C＞k2B，结合因素影响大小，则最优水平组合为A3C2B2，则表明酿酒酵母在培养时间为29h、摇床转速为160(r/min)、培养温度为28℃时生长状况最好。
　　如果试验号没有该水平组合，可补充该组合试验，考察该试验的OD值是否更好。
　　3.2方差分析（可判定对指标的影响程度）
　　极差分析不能将试验中由于试验条件改变引起的数据波动同试验误差引起的数据波动区分开来，即不能区分因素各水平间对应的试验结果的差异究竟是由于因素水平不同引起的，还是由于试验误差引起的，无法估计试验误差的大小。此外，各因素对试验结果的影响大小无法给以精确的数量估计，不能提出一个标准来判断所考察因素作用是否显著。为了弥补极差分析的缺陷，可采用方差分析。
　　方差分析基本思想是将数据的总变异分解成因素引起的变异和误差引起的变异两部分，构造F统计量，作F检验，即可判断因素作用是否显著[3]。
　　（1）计算总离差平方和
　　且
　　其中，n代表总共的试验次数，yi表示每一次的试验结果，表示试验结果的平均数。
　　ST反映了试验结果的总差异，它越大，说明各次试验的结果之间的差异越大。试验差异来源于两部分，第一是由因素水平的变化所引起，二是因为试验误差。
　　（2）计算各因素的离差平方和
　　即各j列组间平方和，j=1,2,3···
　　其中m为水平数，Sj为第j个因素下试验结果的离差平方和，Kij表示j因素下第i表个水平试验值之和。
　　（3）计算误差的离差平方和
　　误差的方差=误差的离差平方和/误差的自由度
　　（4）计算自由度
　　总自由度：dfT=试验的次数1=n-1
　　任一列的自由度（因素的自由度）：dfj=因素的水平数1=r-1
　　误差自由度：dfe=dfT-dfA-dfB-dfC
　　（5）计算均方（平均离差平方和）
　　因素的均方：（A因素的离差平方和/A因素的自由度）
　　误差的均方：（误差的离差平方和/误差的自由度）
　　（6）构造F统计量
　　将各因素的均方除以误差的均方，得到F值。
　　（7）列方差分析表，作F检验
　　按以上计算公式分别计算后，列方差分析表（见表3）。
　　表3
　　变异来源平方和自由度均方F值Fa(临界值)显著水平
　　A SA 2 MSA FA=MSA/MSe
　　B SB 2 MSB FB=MSB/MSe
　　C SC 2 MSC FC=MSC/MSe
　　误差e SE 2 MSe
　　总和ST
　　查表可得F0.01(dfA，dfe)、F0.05(dfA，dfe)、F0.10(dfA，dfe)的值，以培养时间为例进行分析。
　　当FA>F0.01(dfA，dfe)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有高度显著的影响，记作**；在本例中也就是说培养时间对酿酒酵母的生长有高度显著地影响。
　　当F0.01(dfA，dfe)>FA>F0.05(dfA，dfe)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有显著的影响，记作*；在本例中也就是培养时间对酿酒酵母的生长有显著的影响。
　　当F0.05(dfA，dfe)>FA>F0.10(dfA，dfe)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有一定的影响，记作*-；在本例中也就是培养时间对酿酒酵母的生长有一定的影响。
　　同理可对培养温度和摇床转速进行分析，由此可判定培养温度和摇床转速对酿酒酵母生长的影响。
　　（8）验证试验结果
　　经正交试验结果分析可得出最优酿酒酵母培养的条件，最后进行最优试验条件的验证。
　　4.结论
　　正交试验设计在不影响试验效果的前提下，用较少的试验次数了解到全面的试验情况，优化了酿酒酵母的培养条件，以获得高细胞浓度的酵母，大大提高了试验效率。
　　潘玲玲粱丽静李建华泸州职业技术学院
　　参考文献：
　　[1]李聪.酿酒酵母培养条件及发酵培养基的优化[J].中国农学通报,2014,(09):302-306.
　　[2]陈魁，应用概率统计[M].清华大学出版社，2000:280-283.
　　[3]潘丽军陈锦权，试验设计与数据处理[M].东南大学出版社,2008.
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