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探讨高效液相色谱法测定海水鱼中嘌呤含量

2022-01-27 17:01:38来源:金博宝188官网注册 导刊

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严玮桐

(九江市检验检测认证中心食品分中心,江西九江 332000)

摘要:目的:探讨高效液相色谱法(HPLC)测定海水鱼中嘌呤含量的方法和效果。方法:选择新鲜的海鲈鱼、黄花鱼、鳕鱼3种海水鱼类,建立HPLC检测方案,优化色谱条件后测定样品不同部位的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤含量。结果:4种嘌呤在0.1~400 mg/L的浓度范围内,具有良好的线性关系,相关系数均≥0.998,检出限在0.047~0.106 mg/L,在0.021%~0.689%,平均回收率在94.289%~102.919%。不同海水鱼中的嘌呤含量差异明显,总嘌呤含量海鲈鱼>鳕鱼>黄花鱼;同一海水鱼不同部位的嘌呤含量差异明显,总体上鱼皮>内脏>鱼肉。结论:HPLC法测定海水鱼中嘌呤含量的精密度高、回收率好,是一种可行的检测方案。

关键词:海水鱼;嘌呤;HPLC;含量测定;精密度

1 材料与方法

1.1 原料

本次试验所用的海水鱼,选择新鲜的海鲈鱼、黄花鱼、鳕鱼3种鱼类,均购置某水产市场。

1.2 仪器和试剂

电子天平、HPLC仪、pH计、紫外-可见分光光度计、超声清洗器、冷冻高速离心机、真空旋转蒸发仪、绞肉机、电热恒温水槽和超纯水系统等。

色谱级的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤,纯度均>99%;色谱纯甲醇、四丁基氢氧化铵、冰乙酸、三氟乙酸;分析纯甲酸、高氯酸等。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

(1)流动相。参考曲欣[1]的研究,色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm;流动相:水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵,体积比:879∶100∶15∶6;柱温:30 ℃,流速:1 mL/min,进样量:10 μL,检测波长:254 nm。在此基础上进行优化,确定最佳流速和检测波长。

(2)流速。流动相确定后,选择3种流速分离嘌呤,分别是0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min,对比确定最佳流速。结果显示:这3种流速均能在10 min内完成嘌呤的分离,其中0.8 mL/min分离效果最好,峰型最明显,因此确定最佳流速是0.8 mL/min。

(3)检测波长。配置嘌呤溶液,浓度为10 mg/L,然后进行全光谱扫描,设置范围在200~400 nm,从而确定适宜检测波长。结果显示:嘌呤溶液在200~300 nm有吸收峰,腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤的最大吸收波长分别是265 nm、271 nm、254 nm、278 nm。INAZAWA[2]的研究中,波长选择为260 nm;其他学者的研究中有254 nm、255 nm等[3-4]。本次试验分析,发现几种波长的检测结果没有明显差异,最终选择254 nm为检测波长。

经过优化,最终确定色谱条件:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱,4.6 mm×250 mm,5 μm;流动相是水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵,体积比为879∶100∶15∶6;柱温30 ℃,流速为0.8 mL/min,检测波长为254 nm,进样量为10 μL。

1.3.2 样品处理

对海水鱼样品进行处理,目前已知方法有超声法、高氯酸法、混合酸法等。其中,超声法虽然操作简单,但嘌呤的提取率低。高氯酸法操作步骤复杂,等待时间长,容易生成氯气,会危害人身健康。混合酸法不仅对嘌呤的提取率高,而且甲酸对嘌呤具有保护作用。本研究最终采用混合酸法进行样品处理,混合酸的组成是:三氟乙酸和甲酸,两者的体积比是1∶1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

配制单一标准储备液,浓度为1 600 mg/L,置于冰箱内在4 ℃恒温下保存。取等体积4种嘌呤的单一标准储备液,配制混合标准储备液,浓度为4 00 mg/L。然后加入超纯水稀释处理,配制出不同浓度的溶液,分别是200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0.1 mg/L。这些溶液使用0.45 μm的微孔滤膜过滤,然后进行色谱分析,检出限是3倍信噪比对应的浓度。

根据优化后的色谱条件,检测混合标品中的嘌呤含量。以样品浓度作为轴,以峰面积作为轴,进行线性回归分析,得出回归方程,并计算相关系数,见表1。结果显示,这4种嘌呤在0.1~400 mg/L的浓度范围内,具有良好的线性关系,相关系数≥0.998,检出限在0.047~0.106 mg/L。

2.2 精密度

采用优化后的色谱条件,对300 mg/L的混合标品连续进样6次,根据每一次的测定结果,计算相对标准偏差(RSD),见表2。结果显示,6次进样测定值的在0.021%~0.689,说明该方法的精度较高。

2.3 加标回收率

使用电子天平准确称量海鲈鱼的鱼肉样品2.4 g,平均分为12份,每份样品0.2 g。采用混合酸法进行处理,并根据优化后的色谱条件进行检测。按照嘌呤含量的0.5倍、1.2倍,分别加入嘌呤标准品,配制成不同浓度的样品,每个样品测定3次,计算回收率和值,见表3。结果显示,4种嘌呤的平均回收率在94.289%~102.919%,说明该方法处理样品能减少嘌呤的损失量。

2.4 嘌呤含量测定结果

对3种海水鱼样品,分别选择鱼肉、鱼皮和内脏3个部位,按照1.3.2方法进行处理,采用优化后的色谱条件进行检测,得到4种嘌呤含量,并计算总嘌呤含量,见表4。分析可知:①不同海水鱼中的嘌呤含量差异明显,海鲈鱼的次黄嘌呤和黄嘌呤含量最高,黄花鱼的腺嘌呤含量最高,鳕鱼的鸟嘌呤含量最高,总嘌呤含量海鲈鱼>鳕鱼>黄花鱼;②同一海水鱼中,不同部位的嘌呤含量差异明显,内脏中的腺嘌呤和黄嘌呤含量最高,鱼皮中的鸟嘌呤含量最高,鱼肉中的次黄嘌呤含量最高,总体上鱼皮>内脏>鱼肉。

3 结论

HPLC技术具有高压、高速、高灵敏度、进样量少和环保的特点[5]。本次研究针对海鲈鱼、黄花鱼、鳕鱼3种海水鱼类,建立HPLC检测方案,优化色谱条件后测定样品不同部位的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤含量,结论如下。

(1)选用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱,4.6 mm×250 mm,5 μm;以水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵为流动相,体积比为879∶100∶15∶6;柱温30 ℃,流速为0.8 mL/min,检测波长为254 nm。经试验证实,4种嘌呤在0.1~400 mg/L的浓度范围内,具有良好的线性关系,精密度较高,回收率良好。

(2)总嘌呤含量方面:海鲈鱼>鳕鱼>黄花鱼;不同部位方面:鱼皮>内脏>鱼肉。为避免人体内嘌呤含量增高,预防高尿酸血症和痛风,提示人们少食用海鲈鱼,合理食用鳕鱼、黄花鱼;优先食用鱼肉,减少鱼皮和内脏的摄入量。

参考文献

[1]曲欣,林洪,隋建新.高效液相色谱法测定食品中嘌呤含量[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2014,44(12):41-47.

[2]INAZAWA K,SATO A,KATO Y,et al.Determination and profiling of purines in foods by using HPLC and LC-MS[J].Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids,2014,33(4/6):439-444.

[3]吕兵兵,张进杰,储银,等.反相高效液相色谱法检测带鱼糜中的嘌呤含量[J].中国食品学报,2012,12(7):192-198.

[4]郑丽婷,王瑞恒,乐虹雯,等.高效液相色谱法测定啤酒中嘌呤含量[J].现代食品,2021(15):205-209.

[5]张敏敏.超高效液相色谱技术在金博宝188官网注册检测中的应用研究进展[J].乳业科学与技术,2019,42(3):51-56.

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