超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中20种磺胺类药物残留

2021-11-29 15:38:03来源：金博宝188官网注册导刊

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邱慧珍*，黄凤妹，何孝金，江建丽

（南平市食品药品检验检测中心，福建南平 353000）
通信作者：邱慧珍（1988—），汉族，福建南平人，本科，主管药师。研究方向：食品与药品检验技术。E-mail:369172198@qq.com。

摘要：目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法同时检测动物源性食品中磺胺类药物残留。方法：用含0.1%甲酸乙腈提取，均质离心，上清液减压蒸干，2.0 mL的20%甲醇水溶解，2.0 mL正己烷除酯，流动相0.1%甲酸水（含6%乙腈）

-甲醇进行梯度洗脱，采用电喷雾正离子多反应监测模式检测。空白基质加标准物质配制工作曲线，外标法定量。结果：20种化合物在2.0～40 ng/mL线性关系良好，相关系数均大于0.99，在3个加标水平2.0 μg/kg、4.0 μg/kg和10.0 μg/kg上，平均回收率在70.4%～118.1%，相对标准偏差在1.5%～10.0%，定量限为2.0 μg/kg。结论：该方法高效、快速、灵敏度高，可用于动物源性食品中磺胺类药物残留的日常分析。

关键词：质谱；磺胺；兽药残留；动物源性食品

磺胺类药物是二氢叶酸合成酶抑制剂，对氨基苯磺酰胺是此类药物产生药效的基本结构，甲氧苄啶是磺胺类药物的抗菌增效剂，抑制二氢叶酸还原酶，与磺胺类药物合用，对细菌的生长起到双重抑制作用。磺胺类药物是应用广泛的抗生素之一，被用于治疗动物感染，因为它们价格低廉、毒性低，并且对常见细菌感染具有出色的抗菌活性，这些抗生素若不加控制地使用，以及不遵守停药期指南，会导致抗生素耐药性的发展。药物的原形及其代谢产物可蓄积于动物的组织器官或可食性产品中（如蛋、奶）中，从而危及人们的健康。

目前兽药残留的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法等，其中液相色谱-串联质谱法对复杂样品具有高灵敏度、高分辨率等优点，是兽药残留分析的重要手段[1-2]。《国家金博宝188官网注册监督抽检实施细则（2021年版）》中规定磺胺类药物检验的指定方法有《动物源性食品中磺胺类药物残留检测液相色谱-质谱/质谱法》（GB/T 21316—2007）、农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留的测定液相色谱-串联质谱法》、农业部1025号公告-23-2008《动物源食品中磺胺类药物残留检测液相色谱-串联质谱法》，判定依据有农业部公告第235号、GB 31650—2019。实施细则中规定动物源性食品中磺胺类项目以磺胺类（总量）计，如猪肉中磺胺类（总量）项目至少应包含磺胺甲基嘧啶（磺胺甲嘧啶）、磺胺甲恶唑（磺胺甲鯻唑）、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶（磺胺地索辛）、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉（磺胺喹沙啉）和磺胺嘧啶，如检出其他磺胺药物残留，一并计入磺胺类（总量）并判定。

本文着重探讨建立超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中20种磺胺类（甲氧苄啶、磺胺二甲异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲噁唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰、磺胺苯吡唑、磺胺间二甲氧嘧啶及磺胺喹噁啉）药物的检测的方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与设备

TSQ Quantis热电液相质谱仪；Milli-Q超纯水机（美国密理博）；冷冻离心机（德国sigma）；旋转蒸发仪（德国IKA）；均质器（德国IKA）。

1.2 试剂与材料

甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；20种磺胺类标准物质溶液单标（100 μg/mL），购于北京坛墨有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1　色谱条件

菲罗门kinetex色谱柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）；流动相：A：0.1%甲酸水（含6%乙腈），B：甲醇；梯度洗脱程序：0～6 min，25%～45%B；6～9 min，45%～85%B；9～

10 min，100% B；10～12min，100%B；12～15min，100%～25%B；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾正离子模式（ESI+）；多反应监测扫描模式（MRM）；离子喷雾电压3 500V、雾化器温度325 ℃、传输管温度325 ℃、碰撞气N2、辅助器Ar。

1.3.3 标准工作曲线配制

将20种磺胺类标准溶液单标分别配成10 μg/mL标准贮备液，冷冻保存6个月；吸取各标准贮备液配成1.0 μg/mL混合标准溶液，冷冻保存3个月。吸取0.4 mL 1.0 μg/mL的20种磺胺类混合标准工作液于10 mL容量瓶中，乙腈定容，浓度为0.04 μg/mL（该溶液临用现配）。称取5份与试样基质相应的阴性样品2.0 g，分别加入0.04 μg/mL混合标准贮备液0.1、0.25、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL，按照2.6项下处理，最终得到2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL标准溶液。

1.3.4 样品溶液的制备

准确称取2.0 g试样于50 mL离心管内，加入5 g无水硫酸钠和20 mL酸化乙腈（含1%甲酸），用均质机以

10 000 r/min的速度均质30 s，振摇，将离心管置于离心机内以3500 r/min的速度离心5 min，上清液转移至150 mL梨形瓶中，加入10 mL异丙醇，40 ℃下减压旋转蒸发至干，后用2 mL的20%甲醇水溶液溶解，再加2 mL乙腈饱和正己烷涡旋洗脱，于高速离心机中15 000 r/min离心5 min分层，取下层清液用0.25 μm微孔有机滤膜过滤，上机测试。

2 结果与分析

2.1 液相方法优化与典型图谱

水相中加入适量的甲酸，能明显提高色谱的分离效果[3]，综合考虑色谱柱耐酸性和分离效果，添加浓度0.1%甲酸能达到满意效果，水相中加入6%乙腈可抑制霉菌生长，减少流动相更换频率。比较使用甲醇和乙腈作为有机相，发现使用甲醇为有机相时，色谱峰型对称性和效果优于乙腈，最终确定0.1%甲酸水（含6%乙腈）-甲醇的组合[2]。在该色谱条件下猪肉基质阴性样品色谱图显示无明显干扰[3]，空白基质中加入磺胺类物质分离效果与质控样图谱叠加后如图1所示。

注：1-猪肉基质中20中磺胺类药物分离图谱；2-鸡肉中磺胺质控样图谱。

2.2 质谱参数优化与离子信息

在电喷雾正离子模式（ESI+）下，分别对20种（1 μg/mL）磺胺类兽药进行全扫（SCAN），找出母离子参数；在单离子扫描模式下（SIM）找出最佳的碎裂电压，使母离子响应达到最大；在产生子离子模式（Product Ion）下找出一对定量和定性离子，后在多反应监测（MRM）模式下优化碎裂电压，使子离子的响应达到最大值，优化后的参数见表1，带*为定量离子[3-4]。

2.3 前处理方法优化

本实验比较几种国标方法中使用的提取液乙腈-水

（1 000+30）、乙酸乙酯、酸化乙腈（含1%甲酸），实验发现乙腈在提取高脂肪高蛋白基质时有较好的沉淀效果[3-4]；乙腈中加入适量甲酸有助于目标物与基质中蛋白分离，提高回收率[5]，故选择酸化乙腈（含1%甲酸）作为提取液。动物源性食品基质中脂肪含量普遍较高，现有净化方法有过HLB小柱[6]、MCX小柱除脂肪或经过正己烷液液分配法除脂肪，考虑到上样、洗脱等一系列操作烦琐，经考察，样品经旋蒸后加入正己烷涡旋除脂肪，离心过滤后即可得到澄清透明的液体。

2.4 溶剂效应和基质效应考查

比较分别使用纯有机相和初始流动相作为上机液进行分析，用纯有机相上机分析得到前沿峰，峰型较宽；使用初始流动相定容上机分析，峰型正常，对称性好，故最后上机液应使用初始流动相定容。基质效应（Matrix Effect）是基质的存在导致目标物响应产生变化的现象。基质常常对分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，可以通过同等浓度的空白基质匹配标准工作曲线与溶剂配制工作曲线之比，即离子抑制（IS）评价基质效应，离子抑制率（IS）的计算公式如下：

式中：K2-基质匹配标准工作曲线斜率；K1-溶剂配制标准工作曲线斜率。IS＞0，基质增强；IS＜0，基质抑制；IS绝对值越大基质效应越强[7-9]。

2.5 校正曲线和相关系数

取猪肉阴性基质，分别加入20种磺胺混合标液

（0.1 μg/mL）40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、800 μL，按照1.3.4项处理得到2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、40.0 ng/mL浓度水平。以标准溶液的保留时间为横坐标，被测组分的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。具体结果见表2。

2.6 方法的回收率、精密度

取猪肉样品，做3个浓度水平的标准加入回收实验，称取样品后分别加入20种磺胺类混合标液使样品加标水平为2.0 μg/kg、4.0 μg/kg和10.0 μg/kg均按本方法做3次平行测定，回收率及精密度见表3。

2.7 方法的定量限

取猪肉阴性基质样品，加标水平2.0 μg/kg，按上述方法处理，注入液相色谱-串联质谱仪中，测定信噪比，20种磺胺类药物均能满足S/N≥10.0，故本方法的定量限为

2.0 μg/kg。

2.8 测定质控样

取鸡肉中磺胺质控样（含3种磺胺类药物）2份，按照1.3.4样品前处理方法进行测定，测定值在标准值区间范围内，结果如表4。

2.9 测定实际样品

按照上述实验条件测定监督抽检35批鸡蛋、46批禽畜肉、35批水产品，其中1批乌鸡样品磺胺类（总量）160 μg/kg（GB 31650—2019规定应≤100 μg/kg），为不合格样品；1批鸡肉样品甲氧苄啶45 μg/kg（GB 31650—2019规定应≤

50 μg/kg），虽有检出但未超出限量值；其余样品磺胺类（总量）与甲氧苄啶项目均为未检出。

3 结论与讨论

（1）农业部1077号公告-1-2008中试样采用酸化乙腈提取，经正己烷液液萃取净化，内标法定量。内标定量是消除基质效应的常用方法，考虑到内标物价格较贵，同时多个化合物物仅有一两个同位素进行校正，可能造成回收不理想。同一物质在不同基质所造成的基质效应不尽相同，按样品类别选择相适应的空白基质可以有效消除基质效应，提高回收率。

（2）本文建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定动物源性食品中20种磺胺类药物残留方法，样品经过酸化乙腈均质提取，无水硫酸钠除水，正己烷除油脂后上机分析，回收率在70%～120%，加标回收的RSD在10.0%。同时采用基质配工作曲线，以扣除基质效应带来的损失。本方法与国标及其他现有方法相比，无需内标物，省去过柱等一系列烦琐操作，具有准确、便捷、高效、灵敏的特点，可用于动物源性食品中磺胺类药物残留的日常分析。

参考文献

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