贾永红1*，廉立伟2，刘小涛2，周润芝2

(1.浙江万里学院，浙江宁波 315100;
2.宁波市牛奶集团有限公司，浙江宁波 315033)

摘 要：血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)能够抑制血管紧张素酶催化血管紧张素I转化成能强烈收缩血管的血管紧张素II，是降压药物开发的重要分子。本研究以鲜牛奶为原料开展碱性蛋白酶法制备鲜牛奶粗蛋白ACEI混合肽的工艺研究。结果表明，在L25(54)的正交实验中，在40 ℃、pH=11、酶和底物组成比例为1∶30的条件下，水解300 min的效果最好，多肽水解度可达到(46.58±0.77)%，此时ACEI的活力为(50±0.44)%。本研究为提高牛奶高附加值产品开发和利用水平提供基础数据。

关键词：牛奶;碱性蛋白酶;ACEI;工艺

高血压是一种严重危害人类健康的心血管疾病，以血压长时间、持续性升高为典型特征。伴随日常膳食中油脂类、固醇类成分增多，生活节奏加快和压力加大以及生态环境的污染破环，近年来我国高血压患者数量持续增多，已给患者家庭和社会带来沉重的经济和护理负担[1]。据统计，我国高血压患者约3亿，其死亡率约占总死亡人数的42.5%[1-3]。长期以来，高血压病临床治疗药物的作用机制主要包括β受体阻滞剂、利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)、血管紧张素受体阻滞剂、钙拮抗剂及α受体阻滞剂等，虽然降压机制多样，但长期服用会产生耐药性及一些副作用[4-6]。因此，当前以非药物形式如食疗法来治疗高血压的探讨日益增加[5]，特别是一些药食同源的动植物越来越受高血压患者的青睐[7]。

牛奶是一种营养价值丰富、方便易得的日常饮品，其中富含酪蛋白。自从1979年Brantle V等[8]从牛乳酪蛋白酶解产物中获得一个由7个氨基酸组成的短肽以来，牛奶粗蛋白，特别是酪蛋白已经成为生物活性肽制备的主要原料之一。ACEI作为一种对高血压治疗有显著效果的活性多肽，多年来是研究者关注的重点。例如Maruyama[9]从酪蛋白水解物中获得一个ACEI，Nakamura[10]从酸奶中获得两个具有ACEI活性的三肽。

鉴于不同来源的鲜牛奶中蛋白质种类和成分的差异，本项目以宁波本地公司生产的鲜牛奶为原料开展碱性蛋白酶水解牛奶粗蛋白制备ACEI混合肽的研究，并通过正交实验优化多个酶解因素，确定了一条具有较高ACEI混合肽得率的酶解工艺。本项目的研究可为当地乳品企业开展鲜奶精深加工提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鲜牛奶(市售鲜奶)，宁波本地奶业公司;碱性蛋白酶(索莱宝，1∶200 000)，北京;甘氨酰甘氨酰酪氨酰精氨酸四肽标准品(Gly-Gly-Tyr-Arg)(Peptides International)，美国;马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)(Merck)，美国;ACE(Merck)，美国;亮氨酸(Leu)(Amresco)，美国;三氯乙酸、双缩脲试剂、甲醛、硼酸、盐酸、β-巯基乙醇、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟基甲烷、邻苯三酚、盐酸、氢氧化钠、磷酸盐等，均为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜奶粗蛋白的提取及蛋白含量检测

参考吕桂善等[11]的方法并稍做修改，取1 kg鲜牛奶于大烧杯中，将其置于磁力搅拌器上边搅拌边加热至80 ℃左右，约30 min，然后4 000 r/min离心20 min，将其脱脂。用6 mol/L的盐酸调脱脂鲜奶溶液pH到4.6，使蛋白沉淀。接着，4 000 r/min离心15 min去除上清液。再用蒸馏水洗涤粗蛋白沉淀，调节其pH为中性，再次离心去除上清液，将沉淀冷冻干燥，即为鲜牛奶粗蛋白。粗蛋白中蛋白质含量的检测采用凯氏定氮法。

1.2.2 粗蛋白碱性蛋白酶水解物的制备与多肽水解率测定

参考白腾辉等方法并修改[12]。在50 mL蒸馏水中加入一定量的鲜牛奶粗蛋白(15 mg/mL)，磁力搅拌器上充分搅拌使其溶解，根据碱性蛋白酶标示的pH值调节水解酸碱度，然后加入一定量的碱性蛋白酶，在一定温度下的恒温振荡器内水解，持续一段时间后，100 ℃水浴10 min灭酶活以停止酶解反应，将酶解混合液冷却至室温备用。

参考鲁伟等[13]的多肽浓度检测法测定酶解物的肽水解率。取2.5 mL粗蛋白碱性蛋白酶水解物，加入2.5 mL10%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，漩涡混合仪混合均匀后静置10 min，然后以4 000 r/min离心15 min，将上清液全部转移到50 mL的容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，摇匀。之后，取6.0 mL上述溶液置于另一试管中，加入双缩脲试剂4.0 mL(样液∶双缩脲试剂=3∶2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10 min，2 000 r/min离心10 min，取上清液于540 nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中多肽浓度(mg/mL)，进而求得样品中多肽含量。以不同浓度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液为横坐标(mg/mL)，以在OD540为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 粗蛋白碱性蛋白酶水解工艺的正交实验

依据已有的研究报道，本实验设置L25(54)的正交实验表，4因素5水平参数设计如下：温度参数为37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃;pH值参数为8、9、10、11、12;酶和底物组成比例参数为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60;水解时间为60 min、120 min、180 min、240 min、300 min。依据Design Expert软件设计水解组合方案，测定每个组合的多肽水解度。

1.2.4 碱性蛋白酶水解物的ACEI体外活性测定

根据CUSHMAN的方法[14]采用以HHL为底物的非连续分光光度法并稍加改动。将250 μL HHL加入100 μL超纯水或不同酶解条件组合方案所获得的肽混合物后，37 ℃水浴预热5 min，立即加入150 μL ACE保温反应90 min后立即加入250 μL 0.5 mol/L HCl终止反应。空白对照组在加入ACE之前加入250 μL 0.5 mol/L HCl后75 ℃水浴5 min，加入ACE，再保温5 min。反应后加入3 mL乙酸乙酯萃取5 min，静置5 min后移取乙酸乙酯层2 mL至干净试管中，85 ℃水浴蒸除乙酸乙酯，用3 mL 1 mol/L的NaCl溶液溶解萃取出的马尿酸，在228 nm波长分别测定体系的吸光值，计算差值(△ A=A90 min-A0 min)。以单位时间内吸光值的变化表示ACE活力，抑制剂对ACE的抑制作用按下列公式计算：

式(1)中：Ac为加入超纯水时吸光值在90 min内的变化;Ai 为加入抑制剂(实验样品)时吸光值在 90 min 内的变化。

1.2.5 统计分析

采用Excel 2019处理实验数据，以平均值±标准差(Mean±SD)的形式表示。利用Design Expert软件设计正交实验方案，数据分析和作图采用GraphPad Prism生物统计软件，p<0.05认为差异有统计学意义。所有实验数据均重复3次。

2 实验结果

2.1 鲜牛奶粗蛋白的制备

实验结果表明，鲜牛奶粗蛋白的抽提率为2.9%，鲜牛奶粗蛋白中蛋白含量为91.6%。因此，鲜牛奶蛋白抽提率为2.65%。

2.2 粗蛋白的碱性蛋白酶解L25(54)正交实验结果

正交实验结果见表1。值分析表明，多肽水解度的影响因素主次顺序为pH>水解时间>温度>酶和底物组成比例。依据值变化发现，最佳的水解条件组合为：在40 ℃、pH=11、酶和底物组成比例为1∶30的条件下，水解300 min的效果最好，多肽水解度可达到(46.58±0.77)%。

2.3 鲜牛奶粗蛋白酶解物ACEI活性测定

ACEI的结果为(50±0.44)%。见表1。

3 讨论

ACEI是生物活性肽研究领域的热点之一，酪蛋白水解物是ACEI一个重要的制备来源，动物试验及临床研究均显示其具有较好的降血压作用。

本研究开展了碱性蛋白酶法水解鲜牛奶粗蛋白制备ACEI混合肽的实验，借助L25(54)正交设计方案最终确定了在温度为40 ℃、pH=11、酶和底物浓度组合比例为1∶30、水解时间为300 min的条件下可获得(46.58±0.77)%的多肽水解度，此时ACEI活性为(50±0.44)%。

不同蛋白酶的活性位点不同，同时活力大小也受多方面条件影响，因此牛奶粗蛋白多肽水解产物的成分、活性表现等方面差别也很大。例如张秋会等[15]用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白的最佳条件为pH=7.4、温度为40 ℃、水解时间为180 min，酶与底物的比例为1 400∶1(U/g);再有陈旭峰等[16]用胰蛋白酶对牛乳酪蛋白进行水解，在pH为7.5、温度为50 ℃、酶和底物比例为1∶25、水解时间为120 min的条件下，得到具有抗氧化性的酪蛋白水解物。这些结果说明了酶解实验的复杂性。

另外，体外有ACEI活性的多肽有可能到体内后失去活性，也有体外ACEI活性不高，而在体内表现出明显抗压效果的多肽。因此，针对包括ACEI在内的由鲜牛奶粗蛋白经酶解制备而获得的功能寡肽中，其体内外活性大小、稳定性等因素还需要做针对性的深入探讨，这对乳品产业高附加值科技产品的开发都具有重要意义。

参考文献

[1]国家基本公共卫生服务项目基层高血压管理办公室、基层高血压管理专家委员会.国家基层高血压防治管理指南[J].中国循环杂志,2017,32(11):1041-1048.

[2]康玉明,李宏宝,齐杰,等.高血压中枢发病机制的研究进展[J].西安交通大学学报(医学版),2017,38(1):1-6.

[3]揭红波.浅谈心血管疾病的发病机理与预防[J].中外医疗,2011,30(12):184.

[4]Suh H J,Whang J H,Kim Y S,et al.Preparation of angiotensin I converting enzyme inhibitor from corn gluten[J].Process Biochemistry,2003,38(8):1239-1244.

[5]任锦,曹刚,张瑞洁,等.ACE抑制肽的合成及活性研究[J].药学学报,2011,46(1):58-63.

[6]夏磊,胡志和,李艳军.含血管紧张素转化酶抑制肽的酪蛋白水解物与紫薯提取物联用对原发性高血压大鼠血压的影响[J].食品科学,2016,37(19):243-248.

[7]Li G H,Le G W,Shi Y H,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects[J].Nutrition Research,2004,24(7):469-486.

[8]Brantl V,Teschemacher H,Henschen A,et al.Novel opioid peptides derived from casein (β-Casomorphins). I. isolation from bovine casein peptone[J].Hoppe Seylers Z Physiol Chem,1979,360(2):1211-1224.

[9]Maruyama S,Suzuki H.A peptide inhibitor of angiotensin Iconverting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein[J].Agricultural Biology and Chemistry,1982,46(5):1393-1394.

[10]Nakamura Y,Yamamoto N,Sakai K,et al.Purification and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitors from sour milk[J].Journal of Dairy Science,1995,78(4):777-783.

[11]吕桂善,姜瞻梅,周文红,等.酪蛋白水解进程的研究[J].食品工业科技,2003(8):24-27.

[12]白腾辉,潘润淑,马亚萍,等.响应面法优化酪蛋白酶法水解条件[J].食品工业科技,2014,35(23):203-206.

[13]鲁伟,任国谱,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的测定方法[J].食品科学,2005,26(7):169-171.

[14]Cushman D W,Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J].Biochemical Pharmacology,1971,20(7):1637-1648.

[15]张秋会,李苗云,赵改名,等.牛乳酪蛋白水解特性研究[J].现代食品科技,2010,26(10):1130-1131.

[16]陈旭峰,王佳丽,樊伟鑫,等.酪蛋白胰酶水解物的抗氧化活性及稳定性[J].中国乳品工业,2019,47(6):4-9.

基金项目：宁波市农业科技攻关项目(2014C10027)。

通信作者：贾永红(1974—)，男，陕西丹凤人，硕士，副教授。研究方向：活性分子与功能基因。