板栗壳黄酮类成分的提取工艺研究

2021-08-18 22:29:27来源：

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　　板栗壳黄酮类成分的提取工艺研究

　　张琳琳 1，吕华瑛'，王琳 1，石亮2，李克明3

　　（1.山东中医药高等专科学校，山东烟台 264199;2.山东药品食品职业学院，山东威海 264210;

　　3.山东省中医药研究院，山东济南 250014）

基金项目∶山东省中医药科技发展计划项目（2015-218）。

　　摘要∶为了优化板栗壳中的黄酮类成分的提取工艺。分别采用不同溶剂、不同提取方式浸提板栗壳中的黄酮成分，并选取提取次数、加醇量（料液比）、提取时间、醇浓度作为考察因素，设计正交实验对提取工艺进行优化，以芦丁为标准品，硝酸铝-亚硝酸钠比色法，用可见-紫外分光光度计检测提取物中总黄酮的含量，比较总黄酮提取物的收得率，优选最佳提取工艺。结果表明，当选用60乙醇回流提取，提取2次，加醇量为10倍量，提取时间1.5h时板栗壳总黄酮提取率最高，平均提取率为19. 36%.

　　关键词∶板栗壳;黄酮;提取工艺

　　板栗壳为壳斗科植物板栗（Castanea mollissima Bl.）的干燥外果皮，除青海、新疆以外，在辽宁以南各省（市、区）均有栽培，作为中药收载于《中华人民共和国药典四部》（2015 年版）中[1],其药性甘、涩、平，具有降逆化痰、清热散结、止血之功效，常用于治疗反胃、消渴、咳痰、療痂、鈕血、便血及腮腺炎等。

　　板栗壳为板栗的带刺毛壳，即板栗总苞。历代"本草” 对其称呼不同，《证类本草》中称其为“栗毛壳”，《滇南本草》中称其为“子上壳刺”，《本草纲目》《中华本草》《中药大辞典》中均称其为"栗毛球”，江西《草药手册》中称其为“板栗壳斗"，《中国药典》中称其为"板栗壳”，至今, 各名称均有不同程度沿用。

　　近年研究表明，板栗壳含有丰富的黄酮、多糖、酚类等成分PF,文献报道栗壳中含有丰富的天然棕色素，属于黄酮类，不仅可广泛用于食品、日用化学品和药品的着色剂，现代药理研究还显示栗壳黄酮具有抗菌、抗氧化、自由基清除等多方面作用故本课题系统研究并优化板栗壳中黄酮类成分的提取工艺，为其工业化规模生产提供依据。

　　1仪器与试剂

　　板栗，济南市售。

　　电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；FA2004分析天平（上海第二分析仪器厂）；TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；KQE-400B型超声清洗机（济南巴克超声波科技有限公司）；KFS-C2电子天平（凯丰集团）。

　　无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、芦丁标准品。

　　2方法与结果

　　2.1黄酮成分测定

　　釆用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品绘制标准曲线。准确吸取芦丁标准溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、 1.00 mL、1.50 tnL 和 2.00 mL（相当于芦丁 0 ng、75 ng、 150昭、300昭、450 jig和600 gg）,加蒸馅水补足至2 mL,各加入30%乙醇溶液4 mL和5%亚硝酸钠溶液0.5 mL, 振摇后放置5 min,加入10%硝酸铝溶液0.5 mL,摇匀后放置6 min,加l.Omol/L氢氧化钠溶液4 mL,摇匀，放置 15 min,于510 nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以吸光度S为纵坐标、芦丁含量CCgg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到曲线方程为S11.67C-0.016 6,相关系数居=0.999 1,芦丁溶液的浓度在0.017〜0.104 ng/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

　　样品测定。取2 mL样品按照标准曲线绘制的操作步骤进行检测，同样于510nm处进行吸光度的测定。

　　2.2工艺流程

　　将板栗壳洗净后放于60 P烘箱中烘干，粉碎，过40目筛，精密称取栗壳粉样品2 g,加入一定体积的溶剂，在相应温度水浴和浸提时间内浸提，浸提液经5 000 r/min离心 15 min,取上清液，定容至40 mL,放置于4 P冰箱中贮存备用。

　　2.3不同溶剂浸提产率

　　分别釆用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯为溶剂浸提板栗壳中的黄酮成分，将提取成分纯化后用超纯水定容至 100 mL作为供试品试液，按照2.1的方法，测定吸光度，根据标准曲线的回归方程得出不同浸提液中黄酮的浓度，根据公式（1）计算黄酮得率。

　　式（1）中，归为总黄酮产率，%, C为测定总黄酮的浓度，mg/tnL, D为稀释倍数，「为供试液的体积，mL, M 为板栗壳的质量，go

　　不同溶剂浸提板栗壳总黄酮产率见表1。从表1可以看出，乙醇作为溶剂提取黄酮的产率最髙。

　　2.4不同浓度乙醇提取黄酮产率

　　精确称取板栗壳粉样品2.00 g共18份，置于100 mL具塞锥形瓶中，分别加入25 mL 35%, 45%、55%、65%、75%和85%的乙醇溶液，每个处理重复3次。各组样品均在室温下浸泡24h,之后减压、抽滤，滤液瞄于旋转蒸发仪上减压蒸干, 温度控制在60 °C以下。将蒸干的样品称重，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至10 mL容量瓶中，并用30%乙醇定容至刻度，摇匀后测定，按公式(1)计算黄酮产率。实验结果见表2, 从表2可以看出，55%乙醇提取的黄酮产率最高。

　　2.5不同提取方法提取黄酮产率

　　(1)回流提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g,置于 250 mL平底烧瓶中，加入25.0 mL的55%乙醇溶液，浸泡 20 min后加热回流提取30 min,放冷，减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60。(2以下，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至25 mL容量瓶中，用30% 乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。

　　(2)超声提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00g,置于100 mL具塞锥形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡 20 min后在超声波清洗仪上室温超声30 min,超声完毕后减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在 60 °C以下，向干浸膏中加入适量30%乙醇超声溶解，转移至 25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。

　　(3)微波辅助提取法。精确称取板栗壳粉样品2.00 g, 置于250 mL具塞锥形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡55 min(保证样品与浸提溶剂接触的总时间与其他方法一致)，再用微波中火提取5 min(提取中每隔1〜2 min停30 s), 放冷，减压抽滤，滤液放置于旋转蒸发仪中减压蒸干，温度控制在60 P以下，干浸膏用30%乙醇超声溶解，转移至 25 ml量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，测定黄酮产率。平行测定4份，计算平均产率。

　　实验结果见表3,由表3可以看出，55%乙醇回流提取的黄酮产率最高。

　　2.6正交设计

　　影响板栗壳总黄酮含量的因素主要有提取次数、加醇量 (倍量)、提取时间、醇浓度,故以这4个影响因素的3个水平,

　　釆用L9 (3，)正交表设计进行实验，考察板栗壳中总黄酮的含量，结果见表4和表5。

　　由表5的正交试验数据结果可以看出，影响总黄酮含量提取的4个因素按顺序为D>B>C>A，即提取醇浓度 >加醇量〉提取时间〉提取次数。通过4因素3水平的考察, 得出最佳提取条件为AB3C3D3,即提取1次，加醇量为10 倍量，提取时间L5h,提取醇浓度60%时，所得板栗壳总黄酮含量最高，为19.21%。通过方差分析表6可见，因素D、 B、C对试验结果有显著性影响，综合分析实验条件后选择 A2B3C3D3为最佳提取条件，即釆用60%醇提取法，提取2次, 加醇量为10倍量，提取时间1.5 h。在以上工艺优选条件下重复实验3次，平均提取率为19.36%。

　　3讨论

　　板栗营养价值丰富，口感美味，受到广大人民的喜爱，在全国栽培广泛，但板栗壳目前大多被当作废弃物丢弃，造成了资源的浪费，主要原因是人们并未意识到板栗壳的价值所在，对板栗壳的开发利用也未普及推广。党的十八大提出了建设环境友好型、资源节约型社会的要求，加强板栗壳的开发利用也正是响应国家号召的一大举措。

　　本文通过前期对板栗壳的药理作用的文献査阅，发现越来越多的科研人员开始重视板栗壳的重大开发价值，对板栗壳的研究也越来越多，通过研究人们发现了板栗壳具有的许多药理作用，包括抗菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖降血脂和改善脑缺血等人们非常关注的一些作用，当然具体的临床应用还需要进一步的研究。

　　在本实验研究中通过对不同溶剂浸提板栗壳中的黄酮成分，比较总黄酮提取物的收得率，优选最佳提取溶剂为 55%乙醇提取；通过不同提取方式的研究确定了最佳提取方式为55%乙醇回流提取；通过对影响实验的4个因素3个水平的正交试验最终确定了最佳提取工艺为选用60%的乙醇回流提取，加醇量为10倍量，提取次数为2次，提取时间为1.5h,此时板栗壳总黄酮提取率最高，为19.36%。本

　　陆俊,赵安琪，成策，等.核桃营养成分与生理活性及开发研究为工业化规模生产及促进栗壳的临床药用提供了理论依据。

　　参考文献

　　[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典四部[M],北京：中国医药科技出版社,2015.

　　[2]刘义庆.板栗壳中黄酮类生物活性成分的提取与微乳薄层分离分析[J].江汉大学学报(自然科学版),2008,36(4):33-35.

　　[3]冉靓，武子敬，冉阳，等.大孔吸附树脂纯化板栗壳总黄酮的研究[J],安徽农业科学2013,41(2):827-829.

　　[4]何珊珊.板栗壳的化学成分研究[D],成都:西南交通大学,2015.

　　[5]李云雁，宋光森.板栗壳色素抗氧化性研究[J],中国油脂,2004(5):4648.

　　[6]刘平，李云雁，罗渊，等.板栗壳棕色素对活性氧自由基的清除作用[J].食品科技2008(2):175-178.

　　[7]石恩慧，郭凯军，李红，等.板栗总苞多酚■提取工艺优化及其抗氧化性研究[J].动物营养学报,2013,25⑵:406414.