□ 张君超 武冬霞 田秀梅(通信作者) 北京美正生物科技有限公司

□ 柴艳兵 李飞 魏敏 石家庄君乐宝乳业有限公司

摘　要：本实验运用高效液相色谱法对两种商品化肝素亲和柱的柱容量、实际样本纯化效果、重复性及操作便捷性进行了系统性对比，旨在研究两种商品化肝素亲和柱纯化乳及乳制品中乳铁蛋白的性能，同时为相关用户提供选择商品化肝素亲和柱的建议。研究结果显示，两种肝素亲和柱对1mg乳铁蛋白标准品的回收率为90.8%~95.6%，柱容量均能满足常见乳及乳制品中乳铁蛋白的检测需求;对牛乳及乳粉样本中乳铁蛋白的加标回收率为81%~95%，且重复使用3次仍能保持对牛乳及乳粉样本80%以上的加标回收率，即两种肝素亲和柱对乳及乳制品中乳铁蛋白均有良好的纯化效果且3次内可重复使用。在操作便捷性方面，两种肝素亲和柱在保证检测结果准确性的前提下，A柱操作简便、前处理时间短且可同时使用多个A柱检测多个样品，B柱则需要手动加压或使用蠕动泵进行操作，前处理时间较长且无法低成本地同时处理多个样本。综上所述，两种商品化的肝素亲和柱均可满足常见乳及乳制品中乳铁蛋白的纯化需求，在操作便捷性方面A柱优于B柱，相关用户可综合市场、价格等因素选择合适的产品。

关键词：肝素亲和柱 乳及乳制品 乳铁蛋白

1 引言

乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是哺乳动物乳汁中富含的一种天然非血红素铁结合糖蛋白，且具有强大的生物功能，如抗菌、抗氧化、抗癌、促进肠道发育和铁吸收，以及调节免疫系统等[1-3]。因乳铁蛋白具有优质的生物功能，免疫力低下的人群、患有感染性疾病的人群、具有骨质疏松风险的人群，以及缺铁性贫血人群均对于乳铁蛋白的补充有所需求[4]。由于乳铁蛋白热稳定性差，故加热过程中会发生蛋白质变性。一方面，乳铁蛋白作为生鲜乳中的天然成分，如何更多的保留其天然营养活性已成为巴氏杀菌乳研究领域关注的技术重点，“国家优质乳工程”明确提出优质巴氏杀菌乳生物活性物质的指标要求——乳铁蛋白≥25mg/L[5];另一方面，乳铁蛋白常被作为营养强化剂添加入经高温工艺生产的乳制品中，如婴幼儿配方食品和特殊医学用途配方食品等，且《食品营养强化剂使用标准》(GB 14880-2012)中也对乳铁蛋白的添加量也做了明确规定，即在乳品中的添加量不超过1.0g/kg[6]。

据报道，乳及乳制品中乳铁蛋白的检测方法有免疫扩散法、酶联免疫法、免疫层析快速检测法等免疫学分析法，高效液相色谱法、高效液相-质谱联用法/超高效液相-质谱联用法、毛细管电泳法、凝胶电泳检测方法等色谱分析法，以及分光光度法、离子共振法、生物传感测定法、核酸适配体法等[7-8]，但以上众多检验方法均不是国家强制性标准。在众多乳铁蛋白检测方法中，高效液相色谱法因具有反应灵敏、结果准确、重复性好等优点，已被作为团体标准公布实施[9]，同时也被作为食品中乳铁蛋白测定的国家标准征求意见稿中第一法。但该方法对样品纯度要求较高，且乳粉的基质成分相对复杂，故试样无法直接进行液相色谱检测，而需对其进行前处理。目前，常用的前处理方法为肝素亲和柱纯化乳及乳制品中的乳铁蛋白。

肝素(Heparin)是一种含硫酸酯的酸性多糖，可通过糖苷键与一些结构糖蛋白结合，同时肝素表面的负电荷会与带正电的蛋白质发生离子作用。因此，肝素能和抗凝血因子III、凝血酶、类凝血酶、重组人角质细胞生长因子等生物大分子结合。乳铁蛋白也是一种结构糖蛋白，在合适的缓冲液条件下，乳铁蛋白与肝素可通过糖苷键和离子发生亲和作用，故肝素可用于纯化乳及乳制品中的乳铁蛋白。为方便检测，需把肝素制作为填料形式：以高流速琼脂糖微球为基质，采用环氧活化工艺将肝素偶联到琼脂糖凝胶上。目前，市场上已有商品化的肝素亲和柱，但由于各厂家肝素亲和柱的生产工艺不尽相同，造成肝素亲和柱对乳及乳制品中乳铁蛋白的纯化效果也有所差异。本实验对这两种常见商品化肝素亲和柱的柱容量、实际样本纯化效果、重复性及操作便捷性等几个方面进行系统性对比研究，旨在研究两种商品化肝素亲和柱纯化乳及乳制品中乳铁蛋白性能，同时为相关用户提供选择商品化肝素亲和柱的建议。

2 材料与方法

2.1 主要仪器与试剂

2.1.1 仪器

高效液相色谱仪(1260)，Agilent;天平(PL602E)，梅特勒-托利多;亲和柱支架(HMG-QS)，北京华安麦科科技有限公司;涡旋混合仪(HMG-WX)，北京美正生物科技有限公司;高速冷冻离心机(TG16-W)，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;pH计(PHS-3C)，上海仪电科学仪器股份有限公司。

2.1.2 试剂

乳铁蛋白标准品(纯度>95%)，北京美正检测技术有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠均为优级纯，乙腈、三氟乙酸均为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司;0.45μm水系滤膜，天津津腾实验设备有限公司;肝素亲和柱A(3mL)，北京美正生物科技有限公司;肝素亲和柱B(1mL)，美国通用电气医疗集团。

2.2 实验方法

2.2.1 乳及乳制品中乳铁蛋白检测前处理方法

方法一：参照《金博宝188官网注册国家标准 食品中乳铁蛋白的测定》征求意见稿中的第一法。

方法二：参照肝素亲和柱(北京美正生物科技有限公司)产品说明书。

2.2.2 乳及乳制品中乳铁蛋白含量测定

使用高效液相色谱法测定经肝素亲和柱纯化后的试样中乳铁蛋白的含量。固定相：C4色谱柱、(250mm×4.6mm×5μm，300Å)，沃特世科技(上海)有限公司;流动相：A液为0.1%三氟乙酸，B液为乙腈。检测前以最开始洗脱时的AB流动相配比为准，待基线平稳后开始进样;进样体积30μL，梯度洗脱程序如表1所示，柱温30℃，检测紫外波长280nm;检测完成后对色谱柱进行维护：进空针，运行梯度洗脱程序，确认色谱柱无乳铁蛋白洗出后再用甲醇水清洗色谱柱。

试样中乳铁蛋白含量计算公式：

式中：X为试样中乳铁蛋白含量，mg/g;C为由标准曲线计算得到的乳铁蛋白检测浓度，μg/mL;V1为洗脱体积，mL;V2为定容体积，mL;V3为上样液体积，mL;m为试样称样量，g。

2.2.3 肝素亲和柱柱容量对比

肝素亲和柱作为乳及乳制品中乳铁蛋白的纯化工具，柱容量需要满足常见乳及乳制品的检测需求。据报道，鲜牛乳中乳铁蛋白含量约为0.02~0.2g/L，且该成分会随着加工过程中加热时间、pH值、铁饱和度及压力等因素的变化而降低活性和功能[10-12];《金博宝188官网注册国家标准 食品营养强化剂使用标准》(GB 14880-2012)中也规定了婴幼儿配方食品中乳铁蛋白使用不超过1.0g/kg。根据常见乳及乳制品中含量，分别测试两种肝素亲和柱在两种前处理方法下对1mg乳铁蛋白标准品的结合能力，分别平行测定6次，以回收率的平均值和6次测定的相对标准偏差来评价柱容量是否能满足常见乳及乳制品中乳铁蛋白的检测需求。

2.2.4 肝素亲和柱纯化乳及乳制品效果对比

肝素亲和柱应用于乳及乳制品中乳铁蛋白的纯化，但由于乳及乳制品基质复杂，需要分别通过测试两种肝素亲和柱分别在两种前处理方法下对液体乳及乳粉的加标回收率来判定其是否能满足实际样本检测需求。以市售某品牌UHT乳为液体乳阴性样本加标20mg/100g，两种肝素亲和柱在两种前处理方法下分别平行测定3次，以平均值计算加标回收率;以市售某品牌婴儿配方奶粉为乳粉阳性样本(乳铁蛋白标示值为50mg/100g)加标60mg/100g，两种肝素亲和柱在两种前处理方法下分别平行测定3次，以平均值计算实际检出占标示值的百分比和加标回收率。

2.2.5 肝素亲和柱重复性对比

肝素亲和柱纯化乳及乳制品中乳铁蛋白是利用肝素与乳铁蛋白的糖苷键和离子作用，理论上肝素填料经再生后仍可纯化乳铁蛋白，且肝素亲和柱是高效液相色谱法检测乳及乳制品中乳铁蛋白的重要耗材，故重复使用可降低检测成本。本实验用UHT乳和阴性奶粉样本做空白本底，在其中分别加标20mg/100g、60mg/100g，使用方法二测定两种肝素亲和柱的加标回收率及使用次数，实验结果以平行测定3次的平均值计算，每次使用肝素亲和柱用结合缓冲液对两种肝素亲和柱进行再生后再进行下一次检测。

2.2.6 肝素亲和柱操作便捷性对比

肝素亲和柱纯化乳及乳制品中乳铁蛋白的操作过程对于整个检测过程而言十分重要——在保障检测结果准确性的前提下，便捷的操作过程可有效提高检测效率。本实验以实际操作过程对比两种肝素亲和柱的操作便捷性。

3 结果与分析

3.1 肝素亲和柱柱容量对比

两种肝素亲和柱在两种前处理方法下对1mg乳铁蛋白标准品的平均回收率及相对标准偏差如表2所示。实验结果显示，两种肝素亲和柱对1mg乳铁蛋白标准品的回收率为90.8%~95.6%，相对标准偏差为0.92%~1.08%。根据实验结果分析，两种肝素亲和柱的柱容量均能满足常见乳及乳制品中乳铁蛋白的检测需求。

3.2 肝素亲和柱纯化乳及乳制品效果对比

两种肝素亲和柱在两种前处理方法下测定UHT乳加标回收率，婴幼儿配方奶粉实际检出占标示值的百分比和加标回收率结果如表3所示。实验结果显示，两种肝素亲和柱检测UHT乳加标回收率在86%~95%范围内，婴幼儿配方奶粉加标回收率在81%~92%范围内。但在婴幼儿配方奶粉检测中，两种肝素亲和柱使用方法一的实际检出仅占标示值的48%~51%，使用方法二的实际检出占标示值达到110%~113%。结果显示，由于两种前处理方法不同造成实际样本的检测结果有所差异，与肝素亲和柱本身并无相关性。因此，不同前处理方法对样本的适用性有待进一步确证。

3.3 肝素亲和柱重复性对比

使用前处理方法二测定两种肝素亲和柱对UHT乳和空白奶粉样本的加标回收率和使用次数,结果如图1和图2所示。实验结果表明,两种肝素亲和柱对牛乳和乳粉中乳铁蛋白的加标回收率并未随使用次数的增加而明显降低，回收率均在80%以上。实验过程中发现，重复使用肝素亲和柱时必须对其充分再生，否则将影响其下次的回收效率。因此，在实际检测过程中为保障实验结果建议重复使用次数不超过2次。

图 1 肝素亲和柱纯化 UHT 乳中乳铁蛋白重复性能测定(n=3)

图 2 肝素亲和柱纯化乳粉中乳铁蛋白重复性能测定(n=3)

3.4 肝素亲和柱操作便捷性对比

两种肝素亲和柱中，A为重力柱形式且填料粒径较大，B为预装柱形式且填料粒径小。实际操作过程中，A无需借助外力对上样液进行过柱且可以同时对多个样本进行前处理;B则需要手动加压或使用蠕动泵对上样液进行过柱，如要同时对多个样本进行前处理则需增加多个蠕动泵成本。由于A的填料粒径大造成过柱液体流速相对B较快，前处理过程中每个样本可以缩短10~20min前处理时间。

4 结论与展望

本实验对比研究结果显示，两种肝素亲和柱的柱容量均能满足常见乳及乳制品中乳铁蛋白的检测需求;对牛乳及乳粉样本的加标回收率在81%~95%范围内，且重复使用3次仍能保持对牛乳及乳粉样本80%以上的加标回收率。两种肝素亲和柱在保障检测结果准确性的前提下，可同时使用多个A柱检测多个样品且溶液过柱流速较快，即有效缩短前处理时间;B柱则需要手动加压或使用蠕动泵无法低成本同时处理多个样本。综上所述，两种肝素亲和柱均可以应用于乳及乳制品中乳铁蛋白纯化，纯化效果相当，但A柱在操作便捷性上优于B柱，使用者可再综合市场、价格等因素选择合适的产品。

本研究发现，两种肝素亲和柱使用不同前处理方法检测同一种市售婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白含量差异为62%，即两种前处理方法不一定适用于所有乳制品，不同前处理方法对不同乳制品样本的适用性有待进一步研究。

参考文献：

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[2] Human Milk Biochemistry and Infant Formula Manufacturing Technology[M].Elsevier Ltd:2014-01-01.

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[9] 《奶及奶制品中乳铁蛋白的测定 液相色谱法》(T/TDSTIA 006-2019)[S].

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基金项目：国家重点研发计划(2018YFC1604302-04)。