基于银沉积的微间隙阵列电极检测盐酸克伦特罗的方法研究

2021-02-26 16:37:35来源：金博宝188官网注册导刊

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□ 易姿杨丽霞（通信作者）长沙市食品药品检验所

摘要：本文旨在建立一种基于酶催化银沉积的微间隙阵列电极的盐酸克伦特罗检测方法，采用微间隙阵列电极作为基础电极，将竞争性酶联免疫反应与酶催化银沉淀信号放大技术相结合，建立了低浓度盐酸克伦特罗检测的微间隙阵列电极分析方法。该方法通过共价固定BSA结合抗原，经过竞争性免疫反应，捕获碱性磷酸酶结合抗体并催化银沉积。结果显示，盐酸克伦特罗浓度与电导率呈负相关。当盐酸克伦特罗浓度在100μg/L~100pg/L范围内时，盐酸克伦特罗浓度的对数值与检测电导率之间呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9978，检出限为100pg/L，猪肉加标样品回收率在80%以上。故该方法具有灵敏度高、响应快、成本低、操作方便等优点，为盐酸克伦特罗等小分子的快速检测提供了一种有效手段。
关键词：微间隙阵列电极银沉积竞争性免疫反应
盐酸克伦特罗（Clenbuterol hydrochloride，Clen）是一种β2-肾上腺素受体激动剂，主要用于治疗哮喘和肺部疾病。此外，它还具有提升脂肪转化和分解的能力，从而加速动物生长并产生更多的肌肉。因此，Clen会被非法用于饲养动物以增加其瘦肉比例。动物过量摄入此类药物会导致急性中毒，出现肌肉震颤、心悸、头晕等症状，虽然世界卫生组织已禁止在动物饲料中添加Clen，但未能阻止其滥用。因此，Clen的检测在国内外引起了极大关注。目前，已开发出多种Clen检测分析技术，包括高效液相色谱法（HPLC）[1]、液相色谱-质谱法（LC-MS）[2]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[3]、酶联免疫吸附测定法（Elisa）[4]、胶体金免疫检测试纸条法和电化学测定方法[5]等。其中，高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法都存在需要大型仪器设备、成本高、处理时间长等缺点；酶联免疫吸附试验（ELISA）对影响因素的要求相对严格，如温度、pH值等；胶体金法虽然成本低、检测时间短、操作简便，但灵敏度不高，难以准确定量。与以上方法相比，电化学分析不仅具有响应快、成本低、操作方便等优点，还运用了级联酶放大技术以及基于纳米材料、核酸的信号放大技术，显著提高了检测灵敏度，故成为一种很好的选择。
本研究采用微间隙阵列电极芯片，基于酶联免疫竞争法结合酶催化银沉积信号放大系统，进而实现对盐酸克伦特罗的有效检测。本方法具有检测速度快、操作简便、无需大型仪器设备等优点，能应用于肉制品中盐酸克伦特罗的检测。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 试剂
盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白的偶联物（Clen-BSA）、盐酸克伦特罗单克隆抗体（mAb），湖南远泰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）标记羊抗小鼠IgG，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；抗坏血酸磷酸酯（ascorbic acid phosphatase，AAP），sigma公司；AgNO3、甘氨酸，购自国药集团化学试剂有限公司；其他化学试剂均为分析纯；PBS缓冲液（0.01mol/L，pH值7.4）、PBST洗涤液【于PBS缓冲液中加入0.05%（V/V）的Tween-20】、包被液（0.05mol/L，pH值9.6的碳酸盐缓冲液）、封闭液（1%BSA）。
1.1.2 仪器
数显恒温器（LRH-250F），上海一恒科技有限公司；电化学工作站（CHI760D），上海辰华仪器公司；微间隙阵列电极芯片为本实验室设计。

1.2 试验方法
微间隙阵列电极芯片用无水乙醇清洗3次，再用超纯水清洗后晾干；使用浓度为1μg/mL的Clen-BSA包被；加入200μL封闭液，在37℃恒温孵育1h，PBST洗涤3次；加入盐酸克伦特罗单克隆抗体和样品提取液的混合液，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；加入100μL AP标记羊抗小鼠IgG，37℃孵育30min，洗板3次；加入100μL底物溶液【采用灭菌的0.1mol/L甘氨酸-NaOH溶液（pH值9.0）配制的1mmol/L AAP和5mmol/LAgNO3】，混匀，37℃避光孵育10min，用超纯水清洗3次。运用电化学工作站，在0~50mV点位范围内采用线性扫描伏安法检测。

1.3 ELISA方法
加入酶联抗体之前的步骤与微间隙阵列电极分析相同。酶联免疫分析采用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG，用PBST洗涤3次后，加入100μL TMB溶液，37℃避光孵育15分钟。然后加入2mol/L H2SO4终止反应，在450nm处测量吸光度。

1.4 灵敏度分析
使用微间隙阵列电极法对一系列浓度梯度（100μg/L、1μg/L、10ng/L、100pg/L）的盐酸克伦特罗溶液进行检测，确定方法的灵敏度。

1.5 特异性分析
将盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林作为待测样品，进行特异性分析。

2 结果与分析
2.1 最佳包被抗原浓度和一抗浓度确定
微间隙芯片和ELISA法的检测步骤相似，本实验采用ELISA法筛选包被液浓度和一抗浓度。盐酸克伦特罗-BSA偶联物包被液采用1000、100、10、1ng/mL这4个浓度梯度，一抗选取1︰40000和1︰80000两个稀释比例，以此检测空白对照和100ng/mL盐酸克伦特罗的吸光值，结果见表1，选取空白对照和样品结果差值最大的包被液1000ng/mL和一抗稀释度1︰40000用于微间隙芯片实验。

2.2 检测方法灵敏度
盐酸克伦特罗的检测灵敏度采用4个浓度的标准品进行检测，微间隙阵列电极法的灵敏度检测结果见图1。由图1可知，随着盐酸克伦特罗的浓度升高，电化学信号逐渐降低，检测灵敏度可达到100pg/L。传感器的电导率与盐酸克伦特罗的浓度之间呈良好的线性关系，其线性方程为：电导率（pS）=-50.5904LogC+49.88，线性相关系数R2=0.9978。

图 1 微间隙电极阵列法检测灵敏度分析

2.3 检测方法特异性分析
为验证该方法的特异性，测定了盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林这4种瘦肉精，结果如图2所示。从图2可以看出，当加入盐酸克伦特罗时芯片的电导率明显降低，而加入其它瘦肉精或PBST时电导率明显升高。本研究建立的方法对目标物盐酸克伦特罗响应明显，而对其它非目标物无响应，证明该方法特异性较高。

图 2 不同瘦肉精的微间隙电极检测曲线2.4 加标回收率

将建立的微间隙阵列电极检测方法用于实际样品中盐酸克伦特罗的检测，如表2。由表2可知，猪肉样品中盐酸克伦特罗的加标回收率在84.79%~89.74%之间。说明，本实验所建立的检测方法准确度较高，可用于实际样品的测定。

3 结论
本文采用微间隙芯片免疫竞争法检测小分子，待测样品中盐酸克伦特罗的浓度越高，其竞争性结合的单克隆抗体量也就越多，与包被的盐酸克伦特罗-BSA结合到的抗体量越少，最终测定的电极间的电导率也就越小。因此，样品中盐酸克伦特罗含量与电导率呈反比。当盐酸克伦特罗浓度在100μg/L~100pg/L范围内时，盐酸克伦特罗浓度的对数值与检测电导率之间呈良好的线性关系，相关系数为0.9978，检测灵敏度为100pg/L，陈曦等[6]报道的ELISA法灵敏度为5μg/L，国家标准检测方法液相色谱串联质谱法的检测限为0.5μg/kg[7]。该方法用于猪肉的分析，加标样品回收率均在80%以上；检测限高于酶联免疫法和仪器法，与莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林无交叉反应。此外，该芯片的规模化生产及高通量检测仪器设备的研发有助于方法的推广使用。
参考文献：
[1] FREDY M T, SALVADOR V L, ARTURO E M. Application of high-performance liquid chromatography-UV detection to quantification of clenbuterol in bovine liver samples[J]. Journal of food and drug analysis, 2013,(21): 414-420.
[2] THEVIS M, SCHEBALKIN T, THOMAS A, et al. Quantification of clenbuterol in human plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chromatographia, 2005,62: 435-439.
[3] GARCÍA I, SARABIA L, ORTIZ M C, et al. Three-way models and detection capability of a gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of clenbuterol in several biological matrices: the 2002/657/EC European decision[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 515: 55-63.
[4] REN Xiang-fu, ZHANG Fu-mei, CHEN Fa-ju, et al. Development of a sensitive monoclonal antibody-based ELISA for the detection of clenbuterol in animal tissues[J]. Food and Agricultural Immunology, 2009, 20(4): 333-344.
[5] WU Can, SUN Dong, LI Qing. Electrochemical sensor for toxic ractopamine and clenbuterol based on the enhancement effect of graphene oxide[J].Sensors and Actuators B, 2012, (168):178-184.
[6] 陈曦，曹慧，徐斐，等.盐酸克伦特罗酶标抗原的制备及其ELISA检测[J].江苏农业学报，2013，29(2):458-460.
[7] 中华人民共和国国家标准：《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》（GB/T 22286-2008）.

作者简介：杨丽霞（通信作者），博士，高级工程师，从事金博宝188官网注册分子生物学研究。