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摘　要：为建立超高效液相色谱法检测秋葵籽油中苯并芘的含量，故采用分析方法——样品以正己烷溶剂提取，过固相萃取柱，通过超高效液相色谱法检测样品含量。结果显示，在该色谱条件下苯并芘的标曲线性r>0.9999，在洗脱液中加入1mL乙腈氮吹，回收率85.6%~94.5%，苯并芘的检出限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg。因此得出结论，该方法操作简单、效率高、回收率高、结果可靠，适用于秋葵籽油中苯并芘的含量检验。

关键词：苯并芘 秋葵籽油 超高效液相色谱 固相萃取柱

秋葵籽油是从成熟的优质黄秋葵籽中提取出来的纯天然高级食用油，因其富含维他命、蛋白质、卵磷脂及钙、磷、铁、钾、镁等矿物质，所以是一种营养丰富的高档植物油。作为一种新型植物油，秋葵籽油不仅可以用于烹饪、糕点、罐头食品等，还可以加工成人造奶油、烘烤油、调味油(有特殊香味)等以供食用。有报道称，经常食用秋葵籽油可以促进人体血液循环，防止动脉硬化及动脉硬化并发症、高血压、心脏病、心力衰竭、肾衰竭、脑出血，以及抗衰老、改善人脑记忆力，预防老年痴呆症、改善消化系统功能等。此外，人体对秋葵籽油中不饱和脂肪酸的消化吸收率较高，其不仅有助于减少胃酸、阻止发生胃炎及十二指肠溃疡等，还具有润肠功能，长期食用可以有效缓解便秘。在医药领域，秋葵籽油可作为烧伤药、胃溃疡药、伤口愈合药、止痉挛药、神经镇定剂等。正是因为秋葵籽油的营养价值和保健功能，所以引起了医疗、食品、农业等许多领域科学家的关注。采用气相色谱法对秋葵籽的主要脂肪酸成分进行分析，得出其主要脂肪酸含量分别为：豆蔻酸0.2%、棕榈酸30.6%、棕榈油酸0.5%、硬脂酸4.2%、油酸23.8%、亚油酸30.8%、亚麻酸0.3%、花生酸0.6%，且香味香度约为芝麻油的4倍。但是秋葵籽油在生产加工及使用过程中经常处于高温条件下，故可能引起有害物质苯并芘的产生。

苯并芘(Benzopyrene)是一种含苯环的稠环芳烃，其于环境中广泛存在[1]，且在大气中的含量已被列入环境监测的常规项目[2]。最初，苯并芘由煤焦油中分离得到;从煤烟、焦油、沥青、香烟烟雾中都可以检测出来，并且具有强烈的致癌作用——可以诱发肺癌等。根据苯环的稠合位置不同，可将苯并芘分为两种——苯并[a]芘(1,2-苯并芘)和苯并[e]芘(4,5-苯并芘)，后者是前者的同分异构体，存在于煤烟和焦油中。人们日常生活中接触到的大多是苯并[a]芘，英文缩写为B[a]P，CAS号为50-32-8，化学式为C20H12，分子量为252.31。苯并[a]芘在常温条件下的状态是黄色粉末，熔点为179℃，难溶于水，微溶于甲醇、乙醇，易溶于苯、甲苯、二甲苯、丙酮、乙醚、氯仿、二甲基亚砜等有机溶剂。苯并芘在工业上无生产和使用价值，一般只作为生产过程中形成的副产物随废气排放。1933年，英国科学家J.W.Cook等人从沥青中分离得到苯并芘纯品，然后合成证明其化学结构，并进行动物实验，最终诱导小鼠产生了皮肤癌。由此，苯并芘被确认为化学环境致癌物[3]。目前，针对苯并芘测定的相关文献中多采用酶联免疫吸附测定法[4]、胶体金法[5]、气相色谱-质谱联用法[6]、液相色谱-质谱联用法[7]、液相色谱-荧光检测法等[8-16]。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

安捷伦1290型超高效液相色谱仪(配荧光检测器G1321B)，美国安捷伦科技有限公司;EclipsePlus-C18色谱柱(2.1×50mm，1.8μm);BaP-2固相萃取柱、Silica固相萃取柱，月旭科技;固相萃取仪，美国安捷伦科技有限公司;ML204T电子分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司;氮气发生器LCMS30-1-E，英国Parker;氮吹仪N-EVAP 24，美国Organomation;多位涡旋振荡器，广东晋元;超声波清洗器，中国昆山舒美;0.22μm有机滤膜，天津津腾公司。

苯并芘标准物质，Dr.Ehrenstorfer;分析纯二氯甲烷、分析纯正己烷，天津市科密欧化学试剂有限公司;色谱纯乙腈，上海安谱实验科技股份有限公司;实验用水为Milli-Q Advantage A10超纯水，美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

使用十万分之一的天平称取1mg苯并芘标品，用色谱纯乙腈定容至100mL，配制成浓度为10μg/mL的标准储备液;吸取1mL标准储备液用色谱纯乙腈定容至100mL，配制成浓度为100ng/mL的中间标准工作液，然后用色谱纯乙腈稀释成5个不同浓度的标准系列工作液，浓度分别为0.5、1、5、10、20ng/mL;采用超高效液相色谱仪对该系列标准溶液进行上机检测，并建立标准工作曲线。

1.2.2 液相色谱条件

液相色谱柱：EclipsePlus-C18色谱柱(2.1×50mm，1.8μm);色谱柱柱温：35℃;流动相：乙腈︰水=88︰12;流速：0.3mL/min;进样量：5μL;荧光检测器：激发波长275nm，发射波长415nm

1.2.3 样品前处理

提取步骤：准确称样(0.400g)→加入正己烷(5mL)→振荡混匀(20min)→超声提取(20min)→待净化。

SPE净化步骤：将Silica硅胶柱串联在BaP-2固相萃取柱上→活化(5mL二氯甲烷、5mL正己烷)→上样(将净化液加入到串联柱上，并用2mL正己烷润洗盛放样品的离心管，确保完全上样)→淋洗1(5mL正己烷淋洗整个串联柱，然后弃去Silica硅胶柱)→淋洗2(5mL正己烷淋洗BaP-2固相萃取柱)→洗脱(5mL二氯甲烷，收集洗脱液)→定容(洗脱液中加入1mL乙腈，40℃条件下氮吹至近干，用乙腈定容至1mL，涡旋0.5min，经0.22μm滤膜过滤，供UPLC测定)。

2 结果与分析

2.1 线性关系

在“1.2.2”条件下对“1.2.1”系列标准品进行测定，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1、图1。

图 1 苯并芘线性范围

2.2 精密度试验

在“1.2.1”中选择浓度为5ng/mL的苯并芘标准溶液，连续进样6次，记录峰面积。苯并芘峰面积的RSD为0.9%，说明仪器精确度较好，见表2。

2.3 回收率试验

按照GB 5009.27-2016的方法,采用分子印迹柱洗脱后直接氮吹。由于二氯甲烷的挥发性太强而容易将目标物带走，故试验在洗脱液中加入1mL乙腈以防止目标物损失。取阴性样品，苯并芘的3个添加水平分别为2、10、20μg/kg，加入对应体积的标准品后静置过夜，按照“1.2.3”的前处理方法处理样品，然后上机测定，结果见表3。

2.4 检出限和定量限

根据信噪比S/N=3和S/N=10确定目标物的检出限和定量限，苯并芘的检出限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg。

图 2 超高效液相色谱图(5ng/mL)

3 讨论

苯并芘是一类对人类健康危害较大的致癌物，其污染问题长期受到社会关注。秋葵籽中苯并芘产生的来源主要包括以下几点：①新鲜采摘的秋葵籽晾晒在柏油路上，沥青随着高温融化并与秋葵籽慢慢混合;②苯并芘广泛存在于环境中且亲脂性极强，并易在种植、收获及加工等环节受到污染;③秋葵籽在高温下反复烘烤和蒸炒，可能因烧焦而产生苯并芘[17-18]。

本试验利用超高效液相色谱法检测秋葵籽中的苯并芘含量，出峰时间早，节省检测时间，不仅分离度满足试验需求，更可以节省流动相中的乙腈，故实用性较强。秋葵籽油是一种高档植物油，随着生活水平的提高，人们越来越追求饮食健康，因此，加强对秋葵籽中苯并芘的检测能够为人们放心食用秋葵籽油提供数据支持。

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