□ 吴广 贾芳芳 冯才伟 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技术有限公司 北京市金博宝188官网注册免疫快速检测工程技术研究中心

□ 杨筑稀 贵州民族大学社会学与公共管理学院

本文通过制备甲氨基阿维菌素半抗原，研制出一种能够检测蔬菜、水果中甲氨基阿维菌素的胶体金免疫层析试纸条，检测限为5μg/kg，检测时间为15min，假阳性率和假阴性率均为零，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。此外，该试纸条适用于基层实验室的大批量样本检测，具有实际意义，且未见免疫方法相关文献报道，故具有创新性。

甲氨基阿维菌素是从发酵产品阿维菌素B1开始合成的一种新型高效半合成抗生素杀虫剂，溶于丙酮和甲醇、微溶于水、不溶于己烷。因其具有超高效、低毒、低残留、无公害等生物农药的特点，故被广泛应用于蔬菜、果树、棉花等农作物中以防治多种害虫。但是，该药物具有神经毒性和发育毒性，脂溶性强，在动物体内分布广泛且代谢周期长，容易造成药物残留，进而通过食物链危害人体健康。因此，对食品中的甲氨基阿维菌素残留量进行检测十分必要。

目前，用于检测甲氨基阿维菌素残留量的方法大多为仪器方法，但仪器采购成本高、检测时间长、操作复杂，不符合基层实验室高效、便捷的检测要求。因此，本文制备出一种甲氨基阿维菌素的单克隆抗体，并将其应用于胶体金免疫层析试纸条，使其能够满足基层实验室的检测需求，有利于丰富监管手段和提高监督水平。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲氨基阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素等标准品(纯度≥95%)，购自北京标准物质研究中心;氯金酸(HAuCl4·3H2O)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)，购自美国Sigma公司;柠檬酸三钠、碳酸钾，购自北京百欣试剂公司;样本提取剂、样本复溶液、胶体金分析仪，由北京勤邦生物技术有限公司提供;涡旋仪、均质器，购自湖南湘立科学仪器有限公司。

图1 甲氨基阿维菌素半抗原合成

1.2 试验方法

1.2.1 甲氨基阿维菌素半抗原的制备

取0.886g甲氨基阿维菌素，加乙腈70mL溶解，加0.91g氨基丙酸的水溶液2mL，充分搅拌后加入37%甲醛0.32mL与三氯乙酸0.77g，加热，于60℃反应12h，反应停止后加水80mL与乙酸乙酯100mL，萃取分离，减压蒸干，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯体积比5：1洗脱分离，得到丙酸甲氨基阿维菌素半抗原0.76g，收率为77%。

1.2.2 免疫原的制备——甲氨基阿维菌素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联物合成

取丙酸甲氨基阿维菌素半抗原产物36mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC27mg与NHS19mg，充分混匀后反应4h，得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.05M PB溶解，得到B液;将A液滴加到B液中，于4℃反应24h后0.02M PBS透析纯化3天，每天换液3次，得到甲氨基阿维菌素-BSA偶联物，即为免疫原，分装后于-20℃保存。

1.2.3 免疫原的制备——甲氨基阿维菌素半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联物合成

取丙酸甲氨基阿维菌素半抗原产物22mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC17mg与NHS13mg，充分混匀后反应4h，得到半抗原活化液A液;取卵清白蛋白(OVA)50mg，加0.05M PB溶解，得到B液;将A液滴加到B液中，于4℃反应24h后0.02M PBS透析纯化3天，每天换液3次，得到甲氨基阿维菌素-OVA偶联物，即为免疫原，分装后于-20℃保存。

1.2.4 胶体金的制备

取0.01%氯金酸水溶液100mL加热至沸腾;一边搅拌，一边准确加入1%柠檬酸三钠溶液1.5mL;待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸15min，冷却后于4℃避光保存。

1.2.5 甲氨基阿维菌素单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至7.2;每毫升胶体金溶液中加入50μg甲氨基阿维菌素单克隆抗体，混匀后静置10min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的体积百分含量为1%，静置10min;离心、洗涤、重悬，放置4℃备用。

1.2.6 将甲氨基阿维菌素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上

将100μL甲氨基阿维菌素单克隆抗体-胶体金标记物加入至微孔试剂微孔板中，置于冷冻干燥机，冷阱温度为-50℃，预冻3h，然后真空干燥15h，即得到甲氨基阿维菌素单克隆抗体-胶体金标记物冻干的微孔试剂。

1.2.7 检测方法

向微孔中加入100μL待测样本溶液，混匀，室温下孵育3min，吸取70μL滴至试纸条上，反应10min，根据示意图(如图2)判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果。需注意，其它时间判读无效。

图2 甲氨基阿维菌素胶体金试纸条结果判定示意图

1.2.8 样本检测限

向空白蔬菜、水果样本中分别添加甲氨基阿维菌素标准品至质量浓度为0、1、3、5、7、9μg/L，按照“1.2.7”所述方法用3批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限。

1.2.9 试纸条的特异性

分别配制500μg/L的伊维菌素、多拉菌素等药物，用胶体金免疫层析试纸条检测，重复3次，判断试纸条的特异性。

1.2.10 准确性

农业部文件要求：以假阳性率和假阴性率表示胶体金免疫层析法的准确性。取经过仪器确证的50份阴性蔬菜、水果样品(质量浓度小于5μg/kg)与50份阳性蔬菜、水果样品(质量浓度大于5μg/kg)，用胶体金免疫层析试纸条进行检测甲氨基阿维菌素药物残留量，计算假阳性率和假阴性率。《农残办技术材料要求及审查程序》规定，试纸条假阳性率应小于5%，假阴性率应为零。

1.2.11 试纸条的稳定性

将胶体金免疫层析试纸条保存于2~8℃环境中，每隔1个月检测试纸条的准确性，连续测定15个月。具体方法为：分别检测经过仪器确证的20份阴性蔬菜、水果样品(质量浓度小于5μg/kg)与20份阳性蔬菜、水果样品(质量浓度大于5μg/kg)，重复测定2次，根据实验结果判定试纸条的稳定性。

2 结果与分析

2.1胶体金的鉴定

肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好、无杂质、透明度较高。取冷却后的胶体金溶液在透射电镜下观察其颗粒的均一程度并测量金颗粒粒径。经透射电镜观察，胶体金颗粒分布比较均匀，金颗粒的粒径约为20nm。

2.2样本检测限

配置甲氨基阿维菌素浓度分别为0、1、3、5、7、9μg/L的蔬菜、水果样品，按照“1.2.7”步骤进行检测，确定检测限。该试纸条的检测限为5μg/kg，见表1。

2.3特异性

使用胶体金免疫层析试纸条检测500μg/L的伊维菌素、多拉菌素等药物，结果均呈阴性，表明该试纸条特异性较好。

2.4准确性

用胶体金免疫层析试纸条检测50份阴性蔬菜、水果样品，检测结果均为阴性，说明假阳性率低于5%;用该试纸条检测50份阳性蔬菜、水果样品，试纸条检测结果均为阳性，说明该试纸条假阴性率为零，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。

2.5 稳定性

12个月内，胶体金免疫层析试纸条的假阳性率和假阴性率均符合相关要求。从第13个月起，该试纸条会出现少量失效、假阳性等现象。

3 讨论

本研究通过制备甲氨基阿维菌素半抗原，让其与载体蛋白偶联得到免疫原，最终制备出商品化的胶体金免疫层析试纸条。按照《农残办技术材料要求及审查程序》要求，本研究对试纸条进行了特异性、准确性、稳定性等性能测试，结果均符合要求。胶体金免疫层析试纸条的检测时间仅为15min，比现有文献中的仪器方法用时更短，操作更简便。并且，该试纸条检测限为5μg/kg，灵敏度较高。