□ 李留洋 锐德检测技术(天津)有限公司

金黄色葡萄球菌是生活中最常见的病原菌之一，也是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重的感染。该菌对营养的要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧。容易受金黄色葡萄球菌污染的食品主要为乳制品、蛋及蛋制品、各类熟肉制品，其次是含有乳类的冷冻食品等，因此对于该菌的检验也被确定为食品致病性菌种检验中的重要项目。

图 1 样品处理

按照现行的国标方法，金黄色葡萄球菌检测方法分为第一法定性检验、第二法平板计数法(适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品)，以及第三法MPN计数法(适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品)。

第一法定性检验过程包括样品处理、样品增菌、平板分离划线、初步鉴定、确证鉴定这5个步骤，整个流程全部完成至少需要5天时间。第二法平板计数法包括5个步骤——样品稀释、样品接种涂布、典型菌和可疑菌计数、鉴定试验、结果计算，整个流程全部完成至少需要4天时间。第三法MPN计数法同样包括5个步骤，即样品稀释、样品增菌、平板分离划线、鉴定试验、查MPN表确认结果，整个流程全部完成至少需要5天时间。以下将对金黄色葡萄球菌的检测流程进行简单介绍，并对难点、注意事项进行梳理和讲解。

1 第一法：金黄色葡萄球菌定性

1.1 样品处理

固态和半固态样品：称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤中，充分混匀。

液体样品：吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。

1.2 样品增菌

将上述样品匀液置于36±1℃的恒温培养箱中培养18~24h。

1.3 平板分离划线

该步骤是整个金黄色葡萄球菌检测环节中最重要的步骤之一，因为平板划线分离的效果决定了可疑菌落的判定和选择。平板划线选择三分法或四分法则分离效果较好，更容易出现单菌落平板。

图 2 血平板(左)与 BP 平板(右)

1.4 初步鉴定

分离的培养基选用Baird-Parker平板(BP平板)和血平板。结果显示，金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，菌落直径为2~3mm，颜色呈灰黑色至黑色、有光泽，常有浅色(非白色)边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰带，当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感;有时可见到不分解脂肪的菌株——除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同;从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其颜色常较典型菌落略浅，且外观可能较为粗糙，质地较干燥。在血平板上，金黄色葡萄球菌形成的菌落较大，呈圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色)，菌落周围可见完全透明的溶血圈。结合两种培养基的特性即可确定可疑菌落。

1.5 确证鉴定

1.5.1 染色镜检

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞和荚膜，直径约为0.5~1μm。

1.5.2 血浆凝固酶试验

挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个则全选)，分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，在36±1℃条件下培养18~24h。

购买冻干兔血浆，按照说明书加入0.5mL无菌生理盐水溶解，然后加入0.3mL BHI培养物，轻微摇晃至完全溶解或按照说明书直接将0.8mL BHI培养物加入到冻干兔血浆中轻微摇晃至完全溶解(一般选用后者)，置于恒温培养箱中，每半小时观察一次凝集情况，连续观察6h。根据经验，若金黄色葡萄球菌呈强阳性，一般1~2h就可凝集，有的甚至长达3h才会凝集。需注意，切忌直接放置6h才进行观察，因为菌种凝固后会发生自溶现象，隔夜自溶是常见的判断。凝集的最好方法就是倒立观察结块，如倒立后内容物不下落，则效果较好。

1.5.3营养琼脂纯化

典型金黄色葡萄球菌在营养琼脂上一般呈黄色，较容易判断;有些呈淡色、白色，但不常见。如果认为鉴定结果可疑，可挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，36±1℃培养18~48h，重复试验。

图 3 镜检

2 第二法：平板计数法

2.1 样品稀释

固态和半固态样品：称取25g样品至225mL稀释液中(可选用0.85%的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液)充分混匀，即为稀释度10-1溶液，之后进行梯度稀释。

液体样品：吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。

2.2 样品接种涂布

选择性平板采用BP平板，该平板可提前一天配制——洁净台中放置过夜或置于25~50℃培养基中干燥，直到平板表面的水珠消失后备用。该步骤的目的是检查平板是否染菌，最重要的是挥发培养基内部的水分以利于涂布。每个梯度分别吸取1mL样品匀液，以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别接种至3块BP平板上，然后用无菌涂布棒涂布整个平板。如涂布棒不是一次性的，可以提前灭菌备用，也可用酒精灯灼烧2min以上冷却备用。涂布时尽量涂干，注意不要触及平板边缘。此后将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36±1℃培养1h。等样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36±1℃培养24~48h(倒置培养的目的在于防止与空气中的细菌交叉污染，还可防止培养基水分挥发太快)，观察结果。

图 4 典型菌落、阴性及阳性对照凝集效果

2.3 典型菌和可疑菌计数

从图5可以看出，10-1稀释度下菌落生长繁多，难以计数;最适计数范围为20~200CFU，故10-2稀释度满足计数要求，可疑菌总数在适宜计数范围内;而10-3稀释度下可疑菌落很少，故舍去。从10-2梯度上可以看出，具有沉淀环的菌落很多，这就需要从这些菌种中选择5个或以上可疑菌落进行血浆凝固酶试验，但是这5个菌落该如何选择才能使最终的结果最接近真实值是需要技巧的。

首先可以观察到，平板上的可疑菌落沉淀环有两种：一种是和菌落有些距离的沉淀环，记为可疑菌1——经过后期确认试验可知此菌为干扰菌，即表皮葡萄球菌;另一种是从菌落边缘直接延伸出来的沉淀环，记为可疑菌2。将所有可疑菌1与所有可疑菌2的菌落数出来，可判断出可疑菌落是两类不同的细菌。根据两者的比例，决定挑选可疑菌落数的分配情况，比例大的多选，比例小的少选。

图 5 不同稀释度条件下的菌落生长状态

2.4 鉴定试验

平板法的鉴定试验过程及注意事项按第一法的“1.4”“1.5”进行。

2.5 结果计算

①若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20~200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算;

②若最低稀释度平板的典型菌落数小于20CFU，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算;

③若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算;

④若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU，而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20~200CFU范围内，应计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算;

⑤若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20~200CFU之间，应按式(2)计算。

式(1):

式(1)中，T为样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A为某一稀释度典型菌落的总数;B为某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C为某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d为稀释因子。

式(2):

式(2)中，T为样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A1为第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B1为第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C1为第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;A2为第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B2为第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C2为第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;1.1为计算系数;d为稀释因子(第一稀释度)。

3 第三法：MPN计数法

3.1 样品稀释

按照“2.1”进行。

3.2 样品增菌

根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种1mL样品匀液至7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1mL，则用双料7.5%氯化钠肉汤)。每个稀释度接种3管，将上述接种物于36℃±1℃培养18~24h。用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环，移种于Baird-Parker平板，36±1℃下培养24~48h。

3.3 平板分离划线

用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环，移种于Baird-Parker平板，36±1℃下培养24~48h。

3.4 鉴定试验

MPN法的鉴定试验过程及注意事项按第一法的“1.4”“1.5”进行。

3.5 查MPN表确认结果

MPN结果按GB 4789.10-2016中附录C查询。

4 总结

以上便是金黄色葡萄球菌检样3种方法的简单操作过程。该菌检测过程的关键步骤是划线分离和可疑菌落的判定，其中不要放过任何一个可疑菌落;检测人员进行血浆凝固酶试验时，需要注意对时间和凝固现象的把控，有些细节的处理还需要大量经验的积累。