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利用PCR法检测熟牛肉的肉源性

2020-05-14 16:55:40来源:金博宝188官网注册 导刊

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□ 贾南南 李建平 范美霞 菏泽市食品药品检验检测研究院

摘 要:本文旨在建立实时荧光PCR检测熟牛肉中牛、猪、马等动物源性成分的方法。通过对菏泽市市售熟牛肉进行采样检测,提取熟牛肉中总DNA后进行实时荧光PCR检测,确定Ct值,分析样品熟牛肉中牛、猪、马源性成分。通过检测DNA提取液(纯度1.6~1.7),便能满足实时荧光PCR的检测要求。本次采样检测的12批样品中,2批既检出牛源性成分又检出马源性成分,说明样本可能存在马肉掺假为牛肉的问题。

1 引言

随着社会的发展,人们的生活水平不断提高,对肉制品的要求也越来越高。但是,肉制品市场存在肉类掺假、以次充好等欺骗消费者的行为,不法商贩为了追求自身利益以“挂羊头卖狗肉”的方式用劣质肉冒充高质量的肉制品。利用常规的检测方法只能从感官及形态上鉴别肉类,无法从溯源层面解决肉类掺假的问题,例如对于腌制加工的熟牛肉,消费者就很难通过肉眼辨别其是否为牛肉。

随着分子生物学的发展,以DNA为基础的PCR技术被广泛应用于动物源性成分的检测[1-4],即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)溯源是以DNA遗传物质为基础鉴别肉及肉制品。聚合酶链式反应是一种在体外特异性扩增DNA序列的技术,其基本过程为3个阶段的多次循环——模板双链DNA的变性、引物与模板DNA的退火、在DNA聚合酶引导下的链延伸反应,且每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板。就理论而言,扩增产物量呈指数形式上升,即经过n个循环后,产物量增加到2n倍。此方法在动物源性成分检测、肉类掺假鉴别等应用上已有多个报道[7,8]。本研究针对菏泽市市场上销售的肉及肉制品进行抽样检测,利用实时荧光PCR方法鉴别牛、猪、马源性成分,以期发现是否存在掺假的情况,旨在为肉制品掺假检测提供一定的参考依据。

2 材料和方法

2.1 材料

12份市售熟牛肉。

2.2 仪器

绞肉机,小熊电器股份有限公司;金属浴,杭州奥盛仪器有限公司;Rotor Gene Q 荧光定量PCR仪,德国凯杰。

2.3 试剂

无水乙醇,天津市富宇精细化工有限公司;DNA提取试剂盒,天根生物公司;猪源性检测试剂盒、牛源性检测试剂盒,Takara公司;马引物及探针(SN/T3730.5-2013)、PCR体系预混液2xTaqMan Fast qPCR Master Mix(Probe qPCR),上海生工合成。

2.4 样品处理

取适量样品放入烧杯中,用温水冲洗并挤干水分,往复数次,用干净的绞肉机粉碎,备用。

2.5 样品总DNA提取

按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。

2.6 DNA纯度与浓度

打开核酸蛋白检测仪,吸取 DNA溶解液2μL加入加样口,分别测定260nm与280nm吸光度,测定DNA提取液的浓度和纯度。

2.7 聚合酶链式反应(PCR)

2.7.1牛源性实时荧光PCR反应

以提取的各个DNA样品为模板,按牛源性检测试剂盒说明书操作。

图 1 牛源性成分检测

2.7.2 猪源性实时荧光PCR反应

以提取的各个DNA样品为模板,按猪源性检测试剂盒说明书操作。

图 3 猪源性成分检测

2.7.3 马成分检测

以提取的各个DNA样品为模板,作阳性对照、阴性对照、空白对照。

反应体系:2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 10μL、10μM Forward Prime 0.4μL、10μM Reverse Primer 0.4μL、10μM probe 0.4μL、DNF Buffer 2μL、模板DNA 1μL、dH2O 5.8μL。

反应条件:预变性94℃3min,变性94℃5s,退火延伸60℃30s(收集荧光信号),40个循环。

图 2 马成分检测

3 结果与分析

3.1 DNA模板质量

所有样品DNA提取液OD260/OD280值为1.6~1.7,浓度为50~100ng/μL,模板DNA在纯度及浓度上都能够满足进行PCR检测的要求。

3.2 实时荧光PCR 检测结果

分别配制牛、猪源性荧光PCR反应体系和马成分荧光PCR反应体系,Ct值如表1所示。当样品的Ct值不为0且小于35,并有典型的扩增曲线时,则判定样品检出该动物源性成分;反之则为未检出该动物源性成分。

4 讨论

动物源性食品大多为动物组织,其结构紧密,富含蛋白质、脂肪等大分子物质,而熟肉制品在制作过程添加了入味调料等,这些物质会在DNA提取过程中产生共沉淀,倘若提取不当将会影响后续PCR检测。因此,在提取DNA的过程中,去除杂质,得到高DNA纯度尤为重要。本方法在前处理时用温水多次洗涤,去除入味的香料和盐等成分,DNA提取采用试剂盒介质吸附法(硅基质),DNA纯度高,杂质等抑制物少,是PCR成功的保证。检测结果显示,所抽取的市售12批样本中均检出牛源性成分,2批既检出牛源性成分又检出马成分,说明样本可能存在马肉掺假为牛肉的问题。

参考文献:

[1] 陆俊贤,唐修君.利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分[J].食品研究与开发,2017,38(10):110-112.

[2] 陈果.实时荧光PCR检测鸭血中的动物源性成分[J].金博宝188官网注册质量检测学报,2019,10(11):3339-3342.

[3] 苗丽,李志娟等.肉制品中牛源性成分荧光定量聚合酶链式反应方法的建立与应用、[J].肉类研究,2015,29(9):30-33.

[4] 曹际娟,卢行安等.实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技术通讯,2002,13(2):158-160.

[5] Ballin N Z,Vogensen F K,Karlsson A H..Species determination-can we detect and quantify meat adulteration[J].Meaat Science,2009,83(2):165-174.

[6] 高丹丹,陈燕等.动物制品基因组DNA的提取和纯化[J].食品科技,2007,1(8):30-33.

[7] 石盼盼,魏法山等.4种方法提取牛肉干DNA的效果比较[J].金博宝188官网注册质量检测学报,2016,7(7):2920-2925.

[8] 何海宁,洪霞等.实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].食品与机械,2015,31(6):79-83.

[9] 刘辉,杨利萍,张滨.PCR及其改进技术在食品检测中的应用[J].食品与机械,2008,24(4):166-169. [11] 国家企业信用信息公示系统http://www.gsxt.gov.cn/index.html.

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