□ 陶文靖 胡素丽 北京美正生物科技有限公司

□ 赵婷婷 光明乳业股份有限公司华东中心工厂

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摘　要：本文通过对芽孢液体发酵条件进行优化，确定了嗜热脂肪芽孢杆菌产孢培养基的最佳配比：0.8%蛋白胨、0.3%酵母粉、0.3%NaCl、Mn2+0.9mmol/L、Ca2+10mmol/L;最佳发酵条件：pH7.0、接种量0.1%、装液量100mL、培养时间24h、温度65℃。对优化后的综合条件进行检测实验，结果显示，液体发酵产孢率可达48%左右，较优化之前提高15%左右。

关键词：嗜热脂肪芽孢杆菌 液体发酵 培养基 产孢率

1 嗜热脂肪芽孢杆菌的介绍

1.1 嗜热脂肪芽孢杆菌的特性

1917年Smith等在实验室分离出嗜热脂肪芽孢杆菌，1920年Donk将其归类于芽孢杆菌属(Bacillus)并以嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)来命名[1]。2001年，Nazina等将包括嗜热脂肪芽孢杆菌在内的6种菌株从芽孢杆菌属分离出来，并归类为芽孢杆菌属(Geobacillus)，目前该属已经被国际所公认[2]。ATCC、DSMZ，以及国际权威标准和药典等已经将嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)更名为嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，但中国依然习惯称其为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。

嗜热脂肪芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，该菌营养细胞呈长杆、圆端状，多数为单菌落，少数会成对或呈链状排列[3]。嗜热脂肪芽孢杆菌的最佳生长温度为56~60℃，最高生长温度为65~75℃，最低生长温度为35~45℃。此外，该菌是需氧或兼性厌氧菌，消耗葡萄糖产酸不产气，其最适pH值为6.8~7.2，当pH值接近5时该菌就不能生长[4]。培养基的营养成分对芽孢生成率有明显的影响——在培养基中加入无机离子可提高芽孢产率和芽孢热抗力，如钙离子浓度增加可使芽孢的热抗力增强[1]。

1.2 嗜热脂肪芽孢杆菌的应用

嗜热脂肪芽孢杆菌可以作为生物指示剂，由于其产生的孢子具有非致病性、无热原、无毒等特性，并且耐高温和高压，因此被欧洲药典、美国药典和日本药典用作热灭菌生物指示剂。我国也将该菌株列入《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(GB 5981-1995)和《消毒技术规范》(2002版)[5]。此外，该菌还被广泛应用于牛奶中抗生素的检测[6]，乳品中抗生素试剂盒应用的检测方法就是依据嗜热脂肪芽胞杆菌生长、萌发产酸使培养基的颜色发生改变的原理，将其作为检测指标。

2 仪器与材料

2.1 实验仪器

超净工作台：江苏苏净安泰有限公司;pH测试计：ALALIS安莱立思;恒温摇床：上海一恒科学仪器有限公司;电子天平：梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司;磁力搅拌器：IKA仪科;恒温振荡器：常州国华电器有限公司;显微镜：奥林巴斯(北京)销售服务有限公司。

2.2 实验材料和试剂

蛋白胨：北京陆桥技术有限责任公司;酵母粉：北京陆桥技术有限责任公司;NaCl、CaCl2等：北京陆桥技术有限责任公司;NaOH：国药集团化学试剂有限公司。

3 实验方法

3.1 菌株的活化培养

在无菌条件下用接种环取一环诱变后的HY嗜热脂肪芽孢杆菌，接入含有50mL配有培养基的150mL三角瓶里，置于60℃、140rpm/min的条件下在水浴摇床培养18h，制备种子液。

3.2 芽孢镜检及产率计算

①玻片制备：取一片干净的载玻片，于中央处滴加1滴无菌水，在超净工作台内用接种针取菌膜涂于水滴内并混匀。载玻片用酒精灯的外焰过火加热直至菌膜干涸。

②染色：滴加7.6%的孔雀石绿染液于菌膜上，待看到染液上方发烟后开始计时，并不停补色，5min后用细水流冲洗玻片一端，然后用洗耳球吹干水分。滴沙黄复染液，染色5min，冲洗玻片后吹干。

③观察：打开显微镜，用100倍油镜观察。在视野中可看到菌体被染成红色，芽孢被染成绿色。观察结束后，用蘸有乙醚酒精液的擦镜纸擦拭镜头。

芽孢产率计算公式如下：

该式中，Z为芽孢产率;M1为芽孢数;M2为细菌数。

3.3 产孢培养基营养成分的优化

设定基础培养基成分配比及产孢条件：0.5%蛋白胨、0.6%酵母粉、0.3%NaCl、pH7.0、接种量0.1%、装液量100mL、培养时间24h、培养温度60℃。通过单因素实验对基础培养基成分进行实验优化，分别设置实验条件因素如下：

①蛋白胨浓度分别为0.5%、0.8%、1.0 %、1.2%、1.5%、1.8%;

②酵母膏浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%;

③NaCl浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;

④添加MnSO4浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L;

⑤添加CaCl2浓度分别为0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L;

⑥添加FeSO4·7H2O浓度分别为0、1、2.5、5、7.5、10mmol/L;

⑦pH分别选择至6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4。

分别取100mL培养基装入250mL的锥形瓶中，将活化后的嗜热脂肪芽孢杆菌种子液以0.1%的接种量接种到培养基中，置于培养箱中，将温度调至60℃培养24h，通过芽孢染色和显微镜镜检的方法估算芽孢产率，以芽孢产率为指标，重复3次实验，确定培养基中营养成分配比。

3.4 产孢培养条件的优化

以3.3中得到的最优培养基组分为基础，进行发酵条件(温度、时间、接种量)优化。通过单因素实验对产孢条件进行实验优化，分别设置实验条件因素如下：

①培养温度分别设置为55、60、65、70、75℃;

②培养时间分别设置为16、20、24、32、36、40h;

③接种量分别设置为0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%。

通过芽孢染色和显微镜镜检的方法估算芽孢产率，以芽孢产率为指标，重复3次实验，确定最佳产孢条件。

3.5 优化后条件的验证

对经过3.3和3.4实验优化所得到的最优条件进行组合，进行5次芽孢发酵实验，对芽孢产率进行验证。

4结果与分析

4.1 培养基营养成分的确定

4.1.1蛋白胨浓度的确定

依照3.3的实验方案，以最初培养基组成比例为基础，更改蛋白胨的含量分别为0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%，结果如图1所示。

由图1结果显示，在一定范围内，随着蛋白胨浓度的加大，芽孢产率随之升高。当蛋白胨浓度为0.8%时，芽孢产率达到最高，为37.1%;当蛋白胨浓度大于1.0%时，芽孢产率随之呈现下降趋势。所以，确定以0.8%蛋白胨浓度作为以下产孢培养基的成分。

4.1.2酵母膏浓度的确定

依照3.3的实验方案，以前述实验确定的参数为前提，更改酵母膏的浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，结果如图2所示。

由图2结果显示，在一定范围内，伴随酵母膏浓度的加大，芽孢产率随之提高。当酵母膏浓度在0.3%时，芽孢产率达到最高，为34.2%;当酵母膏浓度大于0.3%时，芽孢产率随之呈现下降趋势。通过此实验，确定以0.3%酵母膏浓度作为以下产孢培养基的成分。

4.1.3 NaCl浓度的确定

依照3.3的实验方案，以前述实验确定的参数为前提，更改NaCl的浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，结果如图3所示。

由图3结果显示，在一定范围内，伴随NaCl浓度的加大，芽孢产率随之提高。当NaCl浓度在0.3%时，芽孢产率达到最高，为34.7%;当NaCl浓度大于0.3%时，芽孢产率随之呈现下降趋势。通过此实验，确定以0.3%NaCl浓度作为以下产孢培养基的成分。

4.1.4 Mn2+浓度的确定

依照3.3的实验方案，以前述实验确定的参数为前提，更改MnSO4浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L，结果如图4所示。

由图4结果显示，在一定范围内，伴随Mn2+浓度的加大，芽孢产率随之提高。当Mn2+浓度为0.9mmol/L时，芽孢产率达到最高，为42.6%;当Mn2+浓度大于0.9mmol/L时，芽孢产率随之呈现下降趋势。因此，确定产孢培养基中Mn2+的添加量为0.9mmol/L。

4.1.5 Ca2+浓度的确定

依照3.3的实验方案，以前述实验确定的参数为前提，增加CaCl2 分别为0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L，结果如图5所示。

由图5结果显示，在一定范围内，伴随Ca2+浓度的加大，芽孢产率随之提高。当Ca2+浓度为10mmol/L时，芽孢产率达到最高，为47.2%;当Ca2+浓度大于10mmol/L时，芽孢产率随之呈现下降趋势。通过此实验，确定产孢培养基中Ca2+的添加量为10mmol/L。

4.1.6 Fe2+浓度

依照3.3的实验方案，以前述实验确定的参数为前提，增加FeSO4·7H2O浓度分别为0、1、2.5、5、7.5、10、12.5mmol/L，结果如图6所示。

由图6结果显示，在一定范围内，伴随Fe2+浓度的加大，芽孢产率并没有显著提高，反而对芽孢生长有轻微抑制，所以放弃添加Fe2+。

4.1.7 pH值的确定

依照3.3的实验方案，在以上述确定的参数为前提下，调节培养基的pH值分别为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，结果如图7所示。

由图7结果显示，当pH偏酸性时，芽孢的形成受到抑制。当pH为7.0时芽孢产率最高，为47.2%;当pH高于7.0时，芽孢产率逐渐降低，因此产孢最佳pH为7.0。

通过3.3的实验，确定培养基营养成分的基本配比为：蛋白胨浓度0.8%、酵母膏浓度0.3%、NaCl浓度0.3%、Mn2+浓度为0.9mmol/L、Ca2+浓度为10mmol/L、pH为7.0，以此作为接下来产孢培养实验的培养基成分，继续优化产孢培养条件。

4.2产孢培养条件的确定

4.2.1产孢培养温度的确定

根据3.4的实验方案，进行培养温度对芽孢产率的实验，培养温度分别设置为55、60、65、70、75℃，结果如图8所示。

由图8结果显示，在菌株适应生长范围内，随着温度的提升，芽孢产率有一定的提高，当温度在65℃时芽孢产率最高，为49.7%;当温度高于65℃时，芽孢产率逐渐降低，因此产孢最佳培养温度为65℃。

4.2.2产孢培养时间的确定

根据3.4的实验方案，进行培养时间对芽孢产率影响的实验，培养时间设为16、24、32、36、40h，每隔2~4h进行测试，结果如图9所示。

由图9结果显示，当培养时间为24~28h时，芽孢产率达到48%以上;当培养时间超过32h时，芽孢产率出现降低趋势。分析出现这种趋势的原因可知，随着时间的变化，其培养基的营养成分已经不足以维持菌体的生长繁殖，且菌体逐渐走向衰亡期，活的菌体变少了，所转化的芽孢便会减少。因此，产孢培养的最佳时间为24~28h。

4.2.3接种量条件的确定

根据3.4的实验方案，进行接种量对芽孢产率的实验，接种量分别为0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%，结果如图10所示。

由图10结果显示，在一定范围内，随着接种量的增加，芽孢产率也随之增加，当接种量为0.1%时，芽孢产率最高，为49.7%。当接种量超过0.1%时，芽孢产率降低，这可能是因为培养基中营养物质是一定的，当菌体数量太多时，培养基中的营养物质无法满足菌体的生长需求，会严重影响嗜热芽孢杆菌转化成芽孢的能力，因此最佳接种量为0.1%。

4.3 芽孢产率的确定

根据3.5的实验方案，进行芽孢发酵实验，进行5次平行实验，实验结果如图11显示，经过条件优化后，芽孢产率平均可以达到47.8%。

5 结果与讨论

通过单因素实验对嗜热芽孢杆菌产孢培养条件进行优化，研究了产孢培养基组成成分(蛋白胨、酵母粉、NaCl、Mn2+、Ca2+、Fe2+、pH)以及产孢培养条件(温度、时间、接种量)，以提高嗜热芽孢杆菌产孢率。

本文确定了嗜热芽孢杆菌产孢培养基最佳配比：蛋白胨为0.8%、酵母粉为0.3%、NaCl为0.3%、Mn2+为0.9mmol/L、Ca2+为10 mmol/L、pH7.0、接种量为0.1%、装液量为100mL、培养时间为24 h、温度为65℃。Fe2+的添加对芽孢产率无促进作用。随后通过组合条件的验证，最终液体发酵产孢率可稳定在47.8%左右，较优化之前提高10 %以上。液体发酵虽然产孢率不如固体发酵高，但操作简单，一次可得到的芽孢量远远大于固体发酵。该方法能够提高试剂盒生产企业的工作效率并降低原材料成本。但目前产孢率仍然偏低，还需要进一步优化。

参考文献：

[1] Sasaki K,Shintani H,Itoh J,et al.Effect of Calcium in Assay Medium on D Value of Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 Spores [J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(12):5509.

[2] 周卫民，杨世忠.Nazina T N.Geobacillus 研究进展[J].微生物学杂志，2005，25(3):46.

[3] Donk PJ.A highly resistant thermophilic organism [J].Journal of Bacteriology,1920,5(4):373.

[4] 布坎南R E，吉本斯N E，著.伯杰细菌鉴定手册第八版[M].北京: 科学出版社，1984:743.

[5] 吴潇，刘波，姚粟，李金霞，等.嗜热脂肪芽孢杆菌的特性及应用[J].中国消毒学杂志.2011，28(2):215-217.

[6] GB/T4789.27-2008食品卫生微生物学检验-鲜乳中抗生素残留检验[S].北京: 中国国家标准化管理委员会，2008-27.