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诺如病毒分析检测方法

2017-06-08 10:55:26来源:金博宝188官网注册 导刊

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□ 高光普 本刊记者
诺如病毒感染性腹泻是在全世界范围内的流行疾病,全年均可发生感染,感染对象主要是成人和学龄儿童,寒冷季节呈现高发状态。诺如病毒感染性强,近些年国内外也爆发过多次由诺如病毒引起的病毒感染事件。为了让大家更好地了解诺如病毒,北京良润生物科技有限公司总经理刘磊老师来到了食安大讲堂,向观众分享了他多年来从事诺如病毒研究的相关认知。
诺如病毒感染事件
近年来,国内爆发了多次诺如病毒感染事件:2010年12月,广州从化有429人发病,调查后最终确认是由水污染引起的诺如病毒感染;2013年4月,揭阳市某学院有近400人患感染性腹泻,经当地疾控中心化验判断,主要是诺如病毒传播引起的;2014年2月,嘉兴市有400多名学生感染就医,累计报告发病人数511人;2014年12月,广州越秀区某小学21人发病,波及217人;2015年1月深圳有140名发病,经检测已确定引发此症状的原因系诺如病毒;2016年3月,北京市卫计委公布数据显示,2016年1~2月,北京市报告了31起急性胃肠炎聚集性疫情,其中有28起是由诺如病毒引发。以上每次事件波及的人数众多,对我国人民的生命财产安全造成了很大损失。
诺如病毒检测方法
诺如病毒(Norovirus,NoV),又称诺瓦克病毒,是一组形态类似、抗原略有不同的病毒颗粒。可感染人或动物,引发急性肠胃炎、冬季呕吐性疾病、胃肠性流感等病症,主要临床表现为头痛、发热、恶心、腹痛腹泻等,是非细菌性胃肠炎的主要病原体之一。随着检测技术的不断进步,对于诺如病毒的检测也出现了越来越多的方法,其中代表性的方法有电镜法、免疫法、RT-PCR 3种(对比见表1)。
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诺如病毒最初是通过电镜检测发现的,因此最初的诺如病毒诊断方法主要是电镜法(EM)与免疫电镜法(IEM)。通过电镜观察病毒粒子的形态来确认诺如病毒,需要的病毒浓度较高,因此灵敏度与特异性相对较低,并且只能够在比较专业的检测机构才能进行,无法普及。
随着人们对诺如病毒研究的不断深入,免疫法逐渐被用来检测诺如病毒。免疫法主要有放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)以及酶联免疫法(ELISA)。RIA的灵敏度要比IEM高10~100倍,但需要使用放射元素进行标记,且时间较长(6d);Biotin-Avidin Immunoassy是美国疾病预防控制中心基于RIA建立的简化方法,灵敏度与RIA相近;ELISA具有灵敏度高、耗时少、经济的优点,便于广泛推广,但株型特异性太强,应用范围较狭窄。
随着分子生物学的飞速发展,市场上出现了更加灵敏、特异、快速的核酸检测方法,包括等温核酸扩增(NASBA)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光染料RT-PCR、荧光探针RT-PCR、多重RT-PCR等。RT-PCR方法是目前检测诺如病毒应用最广泛的方法,被称为检测诺如病毒的“金标准”。NASBA直接扩增RNA来进行检测,仪器相对简便,通过琼脂糖凝胶电泳、印迹杂交或者荧光检测来鉴定结果,灵敏度低于RT-PCR;RT-PCR通过逆转录RNA模板、PCR扩增特异性产物,使用琼脂糖凝胶电泳来鉴定结果;荧光染料RT-PCR通过向RT-PCR反应体系中添加非特异性的荧光染料,可以在反应过程中监测扩增产物的生成量,但需要做熔解曲线分析来确定反应的特异性;荧光探针RT-PCR通过特异性的荧光探针与引物,可实时监控反应过程中特异性产物的变化,并且可以实现同一管中多个基因的检测(多重),特异性较好,假阳性率低,检测灵敏度可达10~100拷贝/反应,可用于取代普通RT-PCR。
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