比色法主要是利用了尿素与显色剂的特殊反应产生一种化合物，这种化合物的颜色深浅与尿素的含量为正比。当前，研究和实践当中已经发现的尿素显色反应较多，但可真正用于检测的只有两类，一类是基于二乙酰一肟的反应，另一类是基于2-异亚硝基苯丙酮的反应。而且目前基于这两类反应的试剂种类较多，不同试剂又多有不同的修饰、改进，所以反应出来的颜色也不尽相同，这会对检测波长的选择造成影响，同时还会影响到检测的准确度、灵敏度。在实际的检测过程当中，我们必须要对试剂进行系统性的研究、实验，确定最适合当下发酵酒尿素检测的反应种类和试剂种类。

酶法检测主要涉及脲酶，即尿素酰胺水解酶，在各类豆类植物籽实及细菌中均广泛的存在脲酶，其相对分子质量在120000Da到130000Da左右，其特点是能够对尿素产生特异性水解作用，产生氨气以及二氧化碳。大部分的脲酶最适pH值在偏碱性的范围内或直接为中性，肠道乳酸菌体内的酸性脲酶较为特殊，其最适pH值在2到4之间。对于发酵酒的尿素检测而言，酸性的脲酶是非常合适的，将其加入到发酵酒当中可以对尿素起到分解作用，并产生氨气以及二氧化碳，其生产的氨气和二氧化碳量，与尿素的含量存在直接的关系，所以我们可以以此来判断发酵酒当中的尿素含量。

当前，已经有了基于氨气测定的专门用于尿素检测的试剂盒，且在发酵酒的尿素检测中应用已经较为广泛。其主要利用酸性脲酶来分解发酵酒当中的尿素，进而产生氨气，氨气和2-酮戊二酸及原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在谷氨酸脱氢酶作用下，生成酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷氨酸以及水。在340nm处对原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行吸光值检测，由于原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的减少量与氨的减少量成正比，所以由此可以检测出尿素含量。另外，基于二氧化碳测定也可以来进行尿素检测，方法是把发酵酒的检测样品流动注射到酸性脲酶固体柱当中，然后利用气体扩散装置，对产生的二氧化碳进行分离，再透过膜扩散到溴百里酚蓝溶液中，在617nm处对溶液的吸光度进行测定，以得出二氧化碳的含量，由于二氧化碳的含量和尿素的含量成正比，所以又由此可以得出发酵酒样品当中的尿素含量。

在以往的工作当中，用高效液相色谱法来对发酵酒进行尿素检测是不多见的，因为检测器基本都是紫外检测器，同时尿素最大吸收波长又在203nm，在这样的波长条件下，会对检测的灵敏度、准确性造成影响，实际的检出限较高，在发酵酒的尿素检测中并不适用。后来，有研究人员开发了离子对色谱结合荧光检测器测定葡萄酒中的尿素，其原理是利用固定化脲酶分解尿素产生氨，氨与邻苯二甲醛衍生化后生成产荧光化合物，经离子对色谱分离后可用荧光检测器检测。该方法灵敏度高，但样品前处理繁琐，需经过过滤、脱醇、离子交换、C18预柱除杂等步骤。随后该方法又得到了优化，降低了检出限，并缩短了检测分析时间。另外，有研究人员在酸性条件下，将尿素与二乙酰一肟、安替比林和氯化铁在120℃下反应，反应产物经凝胶柱分离后，在波长466nm处进行检测，间接测定了尿素含量。

在最近的几年来，又出现了新的高效液相色谱荧光检测器方法来检测发酵酒中的尿素含量，这种方法是在酸性条件下9-羟基吨与尿素反应可生成吨基脲，通过特定波长激发光对吨基脲进行照射之后，其便会发射出特定波长的发射光，由于此发射光的强度和尿素的含量为正比关系，所以我们可以通过对发射光强度的测定检测尿素的含量。

袁晓红 浙江省余姚市食品检验检测中心