器材 高效液相色谱-串联质谱仪(Waters TQ-S),酶标仪(ThermoFisher multiskan);离心机(Lynx 6000),涡旋振荡器(pro250),氮吹仪。

　　试剂 硝基呋喃检测试剂盒(COKDA0300)，AOZ标准溶液(Sigma-Aldrich公司)，60%甲醇，1mol/L盐酸，50mmol/L2-硝基苯甲醛二甲基亚砜溶液，0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，1mol/L氢氧化钠，20%甲醇溶液，1mol/L盐酸，2-硝基苯甲醛亚甲基二砜溶液。

　　实验 供试品溶液：HPLC-MS法：称取2g样品，加10mL60%甲醇匀浆2min，离心后弃去上清液，加8mL甲醇洗涤1次，8mL乙醇洗涤1次，8mL乙醚洗涤1次。取标准溶液AOZ使其最终浓度0.5、1、2、4、10ng/mL。每个离心管加入水4mL、1mol/L盐酸1mL、50mmol/L2-硝基苯甲醛溶液0.15mL，混匀。37℃避光16h。加0.1mol/L磷酸氢二钾溶液5mL，用1mol/L氢氧化钠调PH=7.2~7.4。加乙酸乙酯5mL，涡旋5min。离心后取上清液于50℃氮气吹干。加20%甲醇溶液0.5mL溶解，滤过待测。

　　ELISA法：取匀质后的样品1g，加水4mL，1mol/L盐酸0.5mL，10mmol/L2-硝基苯甲醛溶液。37℃置16h，加0.1mol/L磷酸氢二钾溶液5mL，加1mol/L氢氧化钠0.4mL和乙酸乙酯5mL，涡旋30s，离心后取上清液，60℃下氮气吹干，加正己烷1mL和稀释液1mL，涡旋1min，离心后去下层50uL，待测。

　　ELISA法：微孔板回温，分别加标准品和样品50uL，所有微孔加入25 uLAOZ-HRP，25 uLAOZ抗体溶液，密封。混匀孵育1h后倒掉溶液重复3次加300 uL缓冲液，冲洗缓冲液的步骤，加150 uLTMB底物避光孵育30min，加50 uL终止液，放入酶标仪在λ=450和630nm下读数。

　　测定 HPLC-MS法 液相色谱条件：色谱柱Waters BEH(2.1 mm×50 mm，1.7μm);柱温:30℃。进样体积：5.0μl;流速：0.25 ml/min。流动相：0.1%乙酸水(A)和乙腈溶液(B)，梯度洗脱：0min，80%;A=8.5min，A=40%;11min，A=10%。

　　质谱条件：电离方式ESI(+);毛细管电压1.5 KV;离子源温度120℃;锥孔反吹气氮气100 L/h;去溶剂气氮气温度350℃;去溶剂气流量800 L/h;碰撞气氩气流速0.25 ml/min。m/z=236/134的锥孔电压和碰撞电压为25V和13eV，m/z=236/104的锥孔电压和碰撞电压为25V和18eV。

　　结果 27份样品使用两种方法进行检测后，定性结果相同。37份检测结果均为阴性，阳性检出率达到0%，样品合格率为100%。方法的回收率和精密度见表一。

　　表一 AOZ添加回收率和精密度(n=6)

　　方法 添加量

　　(ug/kg) 测得量

　　(ug/kg) 回收率

　　(%) 相对标准偏差

　　(%)

　　HPLC-MS法 0.5 0.473 94.6 6.7

　　1.0 1.065 106 7.2

　　5.0 4.621 92.4 7.9

　　ELISA法 0.5 0.578 116 10.6

　　1.0 0.812 81.2 14.9

　　5.0 4.049 8.10 17.4

　　本文对27份样品进行检测，将HPLC-MS法来作为对照方式，对比ELISA法的检测结果。两种检测方法的定性结果相同，但是HPLC-MS有较好的回收率和精密度。ELISA法由于孵育温度和时间需要精准控制，在大批量样品处理时，可能会影响其结果准确度。因此，HPLC-MS是作为测定鱼肉中硝基呋喃的确证、定量的最可靠方法。

　　虽然ELISA法只是半定量检测方法，但由于其检测限低、易于操作等优势，外加其不受到其他成分干扰，非常适合在批量普查工作中初筛，这对于实验室快速初筛定性鱼肉中的硝基呋喃有积极作用。

　　马青青 许文清

　　河南省疾病预防控制中心 铁道警察学院