实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)实现了PCR从定性到定量的飞跃，可对目标DNA分子起始拷贝数精确定量。因其检测方法精确、灵敏、污染途径少，已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法，在食品中安全微生物的鉴定也有重要应用[1]。沙门氏菌是引起食物中毒最为常见的致病菌，因此，建立食品中沙门氏菌中荧光定量PCR检测方法有重要的研究意义。材料与方法 1菌株：鼠伤寒沙门氏菌(C77-31)有中科院微生物所提供，肉类、奶制品等产品均购于农产品市场。2主要试剂和设备：DNA提取试剂购买于美国Invitrogen公司;Taq酶和缓冲液购买于日本TaKara;opction2荧光定量PCR购买于美国MJ公司;超速离心机购买于Eppendorf;细菌鉴定仪;所用的常规试剂均为分析纯，购买于国药化学试剂有限公司;方法，将标准菌株在XLD、三糖铁斜面和肉汤培养基上培养，从肉汤培养基中取一定量的菌液装入EP管中，离心，去上清，加入双蒸水，沸水浴、冰水浴，离心，取上清。食品样品采用沙门氏菌国标检测法(GB 4789.4-2010)中BPW前增菌之后的培养液装入EP管中，进行相同的操作。引物探针设计，在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象，然后用PrimerPremier5搜索引物和用Oligo验证评估引物。经过筛选进行特异性和灵敏度的实验。

　　表1 引物和探针序列

　　名称 序列 位置 Tm值(℃)

　　上游引物 CCCCTTTTCAATCCACAAA 450-473 57.2

　　下游引物 CCCCTTTTCAATCC 502-530 58.6

　　探针 FAM-AAACGTACCGCTGCA 66.3

　　实时荧光PCR反应体系与反应条件

　　分别考察了不同Taq酶用量，Mg2+浓度、引物浓度和探针浓度对所提取的核酸进行扩增的影响。同时对循环条件也进行了优化。灵敏度实验，将沙门氏菌按照上述的培养条件进行培养，测量OD后估算菌数，然后稀释、涂板确定菌密度，然后用荧光定量PCR进行检测。

　　特异性实验，将沙门氏菌与其他的食品致病菌共同进行特异性实验，做阳性对照实验并用国标法进行验证。

　　结果与分析

　　反应体系的优化 1Taq酶的优化，考察了不同的酶量(0.5至2.5U，每个梯度为0.5)对阳性模板的Ct值的影响，阳性模板Ct值为23.1-23.95之间变化，其影响并不大，当酶量为2.5U时，整个反应体系的荧光量最高。2Mg2+浓度的有优化，从表2中可以看出，不同的Mg2+浓度对阳性模板的Ct的影响并不大，当酶量为3.5U时，整个反应体系的荧光量最高，因此，后续实验也选用该浓度作为最佳浓度。

　　表2 Mg2+浓度对阳性模板的Ct值的影响

　　1.25mmol/L 2.0mmol/L 2.75mmol/L 3.5mmol/L

　　Ct值 24.05 24.25 25.25 26.21

　　3引物探针量的优化，分别选择了引物浓度0.25，0.5，0.75和1.0µmol/L，探针的浓度分别为0.125，0.5，0.75和1.0µmol/L，并以不同的浓度的引物和探针浓度配比，对提取的核酸进行PCR扩增。研究结果表明当引物浓度为0.75µmol/L，探针浓度为0.5µmol/L时荧光效率最高，因此，该浓度作为最佳条件。4循环条件的优化，在第一轮循环前，在94℃下变性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解链。退火是PCR的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃，延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度[3]。从表4中可以看出延伸时温度为60℃较好。

　　表3 循环条件的优化

　　变性 退火 延伸 循环次数 Ct值

　　条件1 95℃，2min 95℃，5s 60℃，40s 40 26.74

　　条件2 95℃，2min 95℃，5s 55℃，10s 40 25.47

　　特异性检测

　　对50份食品分别按照荧光定量PCR、国标法对沙门氏菌进行检测，荧光定量PCR的阳性数为9，国标法为8，其阳性率分别为18%和16%。虽然两种方法的差异并不显著，但是荧光定量PCR检出数相对偏高，检测时间上大大降低。这是由于荧光定量PCR使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。灵敏度检测，荧光PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。按Ct值不大于35.0判断为阳性，建立的方法检测灵敏度可达100CFU/ml。

　　表4 各浓度荧光定量PCR的检测结果

　　106 105 104 103 102 50

　　Ct值 22.12 24.01 28.12 31.12 34.25 37.12

　　通过对荧光定量PCR的反应条件和循环体系条件进行优化，本研究建立的荧光定量PCR检测方法特异性和灵敏度都较高，克服了普通PCR的缺点，为食品中致病微生物的定量研究提供了理论和实践的借鉴意义。