影响凯氏定氮法测定含量准确性应注意的细节问题

　　 阮云飞

　　摘 要：蛋白质是人体生命活动和生存所需的重要有机化合物，随着现代人对食品的营养需求、安全程度的不断提高，对蛋白质食品的含量评判至关重要，这就离不开必要的检测手段，目前常用的方法(GB5009.5-2010)有凯氏定氮法、分光光度法、燃烧法等，但对一般实验室，且易于实施的仍然是第一法——凯氏定氮法。该方法优点是：易于实现、简单可行，且测试准确度较高，但是该方法存在着检测过程较繁琐、费时、关键点控制不准等缺陷，所以，测定时除严格按照标准程序操作外，还需要一定的实验技巧和实践经验。不少实验室在实际操作过程中出现各种问题，导致检测结果异常而不知如何去分析。本文就影响凯氏定氮的因素及细节问题和大家共同探讨。

　　关 键 词：凯氏定氮;蛋白质;测定;准确性

　　1.试剂配制方面。所用的化学试剂均为化学纯，试剂配制把握的原则是快、准、稳，“快” 即速度快、熟练;“准”即试剂称取量把握的准;“稳”即称取试剂过程中不能因为追求速度，导致发生试剂散落、液体流淌等情况;目的是减少各过程间的衔接时间，避免试剂与空气接触时间过长引起不必要的微量变化;同时，要以少配为原则，以防使用时间过长，水分蒸发，导致试剂有效成分不足等现象.

　　2.试样的选取和制备。所采集的样品必须具有代表性，避免受人为和主观因素的影响。所采集的样品必须及时进行分析，固体或半固体样品可适当的绞碎，用物理的方法将其尽可能小化处理，对于液体只需要按照标准吸取或称重一定量的溶液即可。为保证分析结果的准确性，在分析过程中应根据试样蛋白质含量的高低来决定所称试样的重量，如遇蛋白质含量较高的食品，称量的样品量可少一点;遇蛋白质含量低的食品，可适当提高称取量，原则是在称取量范围内合理称取。

　　3.消化过程的控制。首先是添加剂用量，国标为0.2g硫酸铜和6g无水硫酸钾(或无水硫酸钠)，比例为1:30。若添加量加大，消化液易结块不易转移;添加量减少，消化时间加长或者消化不完全。浓硫酸的用量应视试样的重量、含水量及其所含蛋白高低而适当调整。对于体积大重量轻的食品、高蛋白或者含水量较高的试样、淀粉含量多的试样,应适当加大浓硫酸的用量，这是由于此类样品在消化时，浓硫酸在对其脱水和碳化时消耗量加大，当加入的浓硫酸量不足或者刚刚够试样脱水或碳化时就会出现烧干现象。

　　消化温度，可采取逐步加热的方式，起初可低温(200～300℃)加热，待试样焦化泡沫消失后，逐步缓慢提高温度(360～600℃)。消化液转移及定容时，应注意：转移，可在容量瓶口上加上漏斗，且要用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶和漏斗(即采用少量多次原则)，降低因偶然误差而导致测定结果偏低情况。转移完成后不要立即定容，应冷却至室温后再定容。

　　4.蒸馏过程的准备和控制及滴定。首先，蒸汽发生器内的水的体积应控制在其容积的2/3左右，保持水呈酸性，在蒸馏操作开始前，一定要检查一下蒸馏装置的气密性，在检查气密性的同时还应打开冷凝水开关且要保持一定的流速，否则会导致冷却不完全。

　　其次，在移取试样分解液前先把容量瓶摇匀,把移液管用试样分解液润洗2～3次后，再进行移取。

　　据贾艳玲和冷柏忠(2000)实践证明：蒸馏速度一般应控制在每分钟蒸馏出液体在5～7ml之间。

　　蒸馏时间一般以5min左右为宜，加入试样分解液及氢氧化钠后蒸馏4min,使冷凝管末端离开硼酸液面后再蒸馏1min。但是标准中并未规定从何时开始计时，据谢文飞 (2003)的实验证明，在蒸馏完4分钟后再多蒸馏1～2min对结果没有什么影响，所以可以从硼酸刚刚出现绿色时开始计时蒸馏4min(硼酸出现绿色说 明反映已经开始)。最终在4分钟后是否蒸馏完全可用PH试纸进行检测。

　　滴定是整个实验过程的最后一步，至关重要，否则整个实验将前功尽弃。滴定前把盐酸或硫酸标液瓶摇匀后，把酸式滴定管润洗2～3次后加入盐酸标液排除气泡，记下刻度值，开始滴定。滴定时一定要控制好滴定速度，待接收液由浅绿色逐渐变成无色时要放慢滴定速度，逐滴加入盐酸标液，接收液变成浅红色时为滴定终点，切勿滴过量。

　　5.空白测定。另取凯氏烧瓶或者消化管两个，除不加入试样质量，每个试剂的加入量与试样消化时的加入量相同，加热消化至溶液呈透明的蓝绿色，其后的操作步骤完全相同。从经验来讲，空白测定并不需要每次都做，隔一段时间操作一次也可以，但是在更换药品试剂、标准溶液时必须要做空白实验测定。若空白值超标，一般是由于所用试剂级别不够或不纯、蒸馏水不纯、玻璃器皿清洗不干净等原因造成， 必须仔细分析原因。

　　以上是本人用凯氏定氮法(GB5009.5-2010)测定食品中蛋白质含量的一些浅显的体会、经验，不足之处，与大家共同学习探讨。

　　参考文献：

　　[01]张丽英.食品分析及食品质量检测技术(第2版)[M].北京：中国农业大学出版社,2003.

　　[02] 安国民等.测定食品中蛋白质含量应注意的几个问题[J].粮食与饮料工业,2006(5):42.

　　[03] 聂青平,李健.食品样品处理对蛋白质测定值的影响[J].广东食品,1995(3):41～42.

　　[04] 谢文飞.凯氏定氮法测定食品蛋白质的注意细节[J].食品广角,2003(14):17～18.

　　[05] 贾艳玲,冷柏忠.减少食品中蛋白质质测定误差的途径[J].中国食品,2000(18):27.

　　作者单位：涟水县产品质量监督检验所