高效液相色谱法测定动物组织中5种磺胺类兽药残留检测方法的探讨

　　□ 刘海琴 鹤壁市畜产品质量监测检验中心

　　磺胺类兽药是畜禽抗感染治疗中的重要药物，经过各种给药途径进入动物体内，使用不合理很容易在动物组织中造成残留。近几年来由于不科学和超量使用，残留量也随之加大，人们食用磺胺类药物残留超限量的畜禽产品，会出现急性或慢性中毒，影响人体的泌尿、免疫系统，破坏肌肉肾脏和甲状腺等组织，如诱发人的甲状腺癌等，还会导致人体内很多细菌对其产生耐药性。对磺胺类药物残留的检测原理主要是动物组织中磺胺类药物经乙腈振荡提取后，用碱性氧化铝小柱净化，注入高效液相色谱仪反向色谱系统中进行分离，用紫外检测器检测，与标准样品峰面积进行比较，外标法计算磺胺类药物的含量。本文以猪肉样品为例，谈谈有关磺胺残留检测的一些问题。

　　材料与方法

　　仪器与试剂

　　安捷伦1100液相色谱仪-配紫外，R-201旋转蒸发仪，VX-2涡旋振荡器,3-30k高速冷冻离心机，固相萃取装置，碱性氧化铝SPE小柱，乙腈(色谱级),甲醇(色谱级),冰乙酸(分析纯)，正己烷(分析纯),无水硫酸钠(分析纯),SMM，SM2，SMZ，SDM，SQ标准品纯度≥99.7%(中国兽药监察所提供)。

　　样品前处理

　　试料制备与保存

　　从全部猪肉样品中取出有代表性猪肉样品约1kg，用匀浆机充分搅碎，均分成2份，分别装入洁净容器内，密封成为试样，标明标记，于-18℃冷冻保存(临用前解冻并恢复至室温)。

　　提取溶剂、分离、净化方式等

　　主要前处理过程

　　称入样品5.0g(精确至0.0001g)于具塞离心管中，加入5g无水硫酸钠，加入15mL乙腈匀浆后，于涡旋震荡器上4000r/min振荡5min，5000r/min离心5min，上清液全部转移至预先加入20mL正已烷的离心管中，试料中再加入15mL乙腈重复提取一次，离心后的上清液一同转移至离心管中，振摇、静置分层。取下层液，加入正丙醇5mL，50℃减压至近干。

　　碱性氧化铝SPE柱临用前用95%乙腈预洗，浓缩物用95%乙腈3mL溶解后过柱;再加95%乙腈5mL洗涤鸡心瓶并将溶液过柱、挤干，弃去过柱液。用70%乙腈10mL洗脱，洗脱液收集到鸡心瓶中，挤干，洗脱液加入5mL正丙醇，50℃减压浓缩至干，浓缩物用2.0mL流动相溶解，用微孔滤膜过滤，收集至进样小瓶中，上机测定。

　　仪器设置

　　色谱条件：色谱柱：C18柱，250mm×4.6mmid;流动相∶乙腈∶甲醇∶水∶乙酸(2∶2∶9∶0.2);流动相流速：1.0mL/min;检测波长：270nm;进样量：20μL样品一式两份。

　　色谱分析：配制好的标准溶液与净化后的样品分别进样，以保留时间定性，以样品溶液峰面积与标准溶液面积比较外标法定量。

　　结果

　　定性：样品中未知组分的保留时间(Rt)分别与标样的保留时间(Rt)相比较，如果样品中某组分的两组保留时间与标准中某一药物的两组保留时间一致即可认定为该药物。

　　计算：样品中被测兽药残留量以质量分数w计，单位以毫克每千克(mg/kg)表示，按以下公式计算。

　　结果与讨论

　　样品加入乙腈后提取时间要充分，要将样品中的磺胺类药物溶解在乙腈试剂中，且样品之间的提取时间尽可能一致，前者为提高回收率，后者为提高样品之间的精密度，样品提取液上柱(SPE柱)时，一定控制溶液流速，最好不大于10滴/min,如果流速过快,样品中的磺胺类药物不能够完全吸附在SPE萃取柱,从而造成药物流失.萃取柱的质量最关键,有的柱子活化时还没有上样就堵,或者在上样的过程中堵得厉害,1～3min还没有流1滴,这样情况下,应该将其丢弃,重新做样。

　　样品在提取过程中，50℃减压干燥室一定注意负压不能太高，否则，容易造成药物随着蒸气流失，会使试样处理液中磺胺浓度降低，浓度越低信号越弱，回收率也会相应降低。

　　阳性样品回收率比较实验：在5.0g猪肉样品中分别添加5μg/mL磺胺类药物混标溶液100μL,500μL按样品前处理步骤处理和测定，浓度相当于含0.1mg/kg,0.5mg/kg的磺胺类药物，测定结果显示，猪肉中的回收率在90.36%～96.50%范围内，标准偏差在0.58%～0.95%范围之间，回收率高，且相同浓度下回收率稳定性好，低浓度的添加要普遍高于高浓度的添加。

　　如图1、2(图中1～5分别代表磺胺二甲基嘧啶，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺甲唑，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺喹啉)所示：磺胺二甲基嘧啶的出峰时间是5.762左右，磺胺间甲氧啶的出峰时间是7.553左右，磺胺甲唑的出峰时间是8.690左右，磺胺二甲氧嘧啶的出峰时间是16.776左右，磺胺喹啉的出峰时间是18.005左右。图1是低浓度0.2μg/mL的色谱图，图2是高浓度1.0μg/mL的色谱图，由图可知，低浓度标准品的峰谱图(图1)受试剂峰(杂峰)的干扰大，高浓度标准品的峰谱图(图2)则受试剂峰的干扰较小。在做样品过程种，由于样品的药物含量是未知的，需要配制由低到高梯度的标准品浓度，以满足不同含量不同的样品的计算，可以根据样品含量的多少选择相应的浓度点进行单点校正，或者绘制标准曲线，通过在曲线图上查找，得到样品相应的浓度。多点校正一般情况下确定(5～7个点)，浓度范围是0.1～20.0μg/mL之间。

　　结论

　　实验表明，猪肉经乙腈先后两次得以充分提取，加入正己烷脱脂后浓缩、净化后再浓缩，用流动相定容，采用高效液相色谱法C18色谱柱和紫外检测器测定，一次进行5种磺胺类兽药残留测定。此方法操作简单，单样检测时间约30min，样品的提取也比较简单，样品加标回收率在90.36%～96.50%之间，标准偏差在0.58%～0.95%之间，适合动物组织中5种磺胺类药物的大批量检测。通过多年来经过对各类动物组织检测的结果表明，该方法主要具有回收率高的特点，解决了药物残留提取不完全的问题，满足市级检测单位对动物组织中5种磺胺类兽药残留日常检测需要。