QuEChERS样品制备方法应用于LC/MS和LC/UV测定橙汁中多菌灵 和其他康唑类杀菌剂

　　□ 沃特世 供稿

　　本文讨论了橙汁中康唑类杀菌剂(包括多菌灵)的样品制备策略。首先，使用QuEChERS方法的DisQuE产品进行样品制备，用以检测各种水果、蔬菜和果汁中的杀虫剂含量。结合QuEChERS方法，UPLC/MS/MS可以轻易检测出10μg/L(ppb)包括多菌灵在内的5种康唑类杀菌剂，且无需进行进一步的样品制备操作。QuEChERS提取液可以作为前体样品，然后进一步净化并使用液相色谱UV检测器分析其中ppb水平的多菌灵和其他康唑类杀菌剂目标分析物。利用Oasis MCX小柱进行固相萃取(SPE)可对待测物进行富集，并减少基质干扰。该方法通过使用配备UV检测的液相色谱可完成多菌灵样品在低ppb水平的准确定量。Oasis MCX净化操作虽然不是UPLC/MS/MS分析的必需步骤，却能够减少基质效应而得到更加洁净的提取物。因此，使用QuEChERS方法DisQuE产品制备的样品适用于UPLC/MS/MS直接分析，及经混合模式SPE富集和净化之后的HPLC/UV测定。

　　沃特世解决方案

　　Xevo® TQ质谱;ACQUITY UPLC® H-Class系统;ACQUITY UPLC BEH C18柱;XBridgeTM BEH C18XP色谱柱;DisQuETM试剂袋产品;Oasis® MCX萃取柱;LCMS认证样品瓶。

　　实验

　　用作质谱分析的UPLC条件

　　系统：ACQUITY UPLC H-Class;

　　色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm(部件编号：186002352);

　　进样量：10μL;

　　温度：40℃;

　　流动相A：0.1%NH4OH水溶液;

　　流动相B：0.1%NH4OH甲醇溶液;

　　流速：0.40mL/min;

　　梯度：流动相B初值为10%，4分钟内线性梯度增至90%，保持5分钟，降回至10%B，持续5.1分钟。保持并再平衡7分钟。

　　用作XP色谱柱UV分析的HPLC条件

　　系统：ACQUITY UPLC H-Class;

　　检测：PDA检测器;

　　色谱柱：XBridge C18XP，4.6×100mm，2.5μm(部件编号：186006039);

　　进样量：50μL;

　　温度：40℃;

　　流动相A：20mm磷酸钾水溶液(pH6.8);

　　流动相B：乙腈;

　　流速：1.3mL/min;

　　梯度：25%B的初值保持3.4分钟，9.7分钟内线性梯度增至65%B，保持11.0分钟，然后线性梯度增加至95%，保持13.0分钟，之后降回至25%B，持续13.2分钟。保持并再平衡18.3分钟。

　　样品制备

　　使用QuEChERS方法进行初步提取：将15mL橙汁样品加到50mL的离心管内。加入15mL1%乙酸乙腈(ACN)溶液，振摇1分钟。加入为AOAC QuEChERS方法准备的DisQuE试剂(部件编号186006812)，剧烈摇匀1分钟。然后在3000rpm下离心5分钟。对不使用固相萃取，直接进行UPLC/MS/MS分析的样品，将0.5mL上清液加水稀释至1.0mL。

　　SPE净化：使用Oasis MCX小柱的固相萃取方法可对碱性化合物(例如康唑类杀菌剂)进行净化。准备进行LC/UV分析前(如果需要净化样品)，从QuEChERS提取物中取2mL上清液，加入6mL0.01M HCl水溶液，然后混均。使用一根3cc Oasis MCX柱进行固相萃取净化操作。QuEChERS提取液以酸性水溶液稀释，从而提高混合模式SPE保留，同时水溶液稀释增加了反相保留。

　　质谱条件

　　质谱仪：Waters® Xevo TQ。

　　结果与讨论

　　使用QuEChERS方法能够在UPLC/MS/MS分析之前有效地萃取康唑类杀菌剂。其中的一种杀菌剂——多菌灵，未经注册却被确证出现在市售的橙汁样品中。本实验通过质谱分析实现了该化合物在1ppb的水平上的确证，同时LC/UV检测限也达到了10ppb水平。研究结果显示，使用了QuEChERS样品制备方法的DisQuE产品，不仅能够对康唑类杀菌剂进行有效的UPLC/MS/MS分析，而且通过适当的净化操作步骤，还能使用LC/UV检测出较低ppb水平的杀菌剂。

　　以上测定结果也验证了一个重要的结论：对于大部分基质中存在的多种杀菌剂及相关化合物，QuEChERS方法是一种非常有效的样品制备技术。随后的样品净化程度完全取决于分析人员的需求、检测方法的灵敏度和特异性。分析过程表明，虽然SPE净化步骤只是推荐性而非高效率的UPLC/MS/MS分析所必需的过程，但是另一方面，要实现低ppb水平的多菌灵LC/UV测定，则必须进行包括随后Oasis MCX的固相萃取过程。

　　不使用SPE净化的UPLC/MS/MS

　　分析

　　通过对每种杀菌剂的10ppb加标(多菌灵为1ppb)橙汁样品的UPLC/MS/MS重现图谱的分析，使用外标计算方法得到的五点基质匹配曲线(未示出)中，所有康唑类杀菌剂的相关系数(r2)都大于0.995。根据橙汁基质中制备的3份平行样品得到的结果测定康唑杀菌剂的回收率，其范围为92%～110%且相对标准偏差(%)小于7%。回收率实验的具体操作方法：分别在QuEChERS萃取之前和萃取后的果汁样品中进行杀菌剂加标，并将两者所得的MRM峰面积进行对比。基质效应(抑制比%)由QuEChERS萃取后的杀菌剂加标上清液的MRM峰面积与用50∶50乙腈/水制备的等量杀菌剂标准品峰面积进行对比得出。

　　使用SPE净化的LC/UV分析

　　使用SPE净化的LC/UV回收率与100ppb水平加标样品的UPLC/MS/MS分析结果相似。图1是使用XP色谱柱的LC/UV方法测定抑霉唑、腈苯唑和苯醚甲环唑所得的色谱图。多菌灵和噻菌灵在可见的280nm至300nm处缺少有效发色团;然而在220nm处却能达到很高的灵敏度，这在很大程度上是因为使用了紫外可穿透的流动相(磷酸钾)。

　　已测样品的分析

　　图2是对已测橙汁样品分析得到的LC/UV色谱图。可看出使用Oasis MCX小柱可获得高水平样品净化效果。上方为未使用SPE净化的色谱图，下方为使用Oasis MCX净化后的色谱图。图3是同时使用QuEChERS方法和Oasis MCX小柱净化后得到的色谱图，以及对相同的样品只使用QuEChERS方法而未使用Oasis MCX小柱净化的UPLC/MS/MS图谱。结果吻合度良好，LC/UV检测到11ppb的多菌灵，UPLC/MS/MS检测到13ppb的多菌灵。在受检的橙汁样品中未鉴别出其他杀菌剂。图4是已测样品的UV图谱与ppb标准品得到的参比图谱的对比，证实了橙汁样品中残留物的存在。

　　结论

　　DisQuE试剂袋(QuEChERS)能够有效地从橙汁中萃取康唑类杀菌剂;该方法可提供高通量和低检测限的分析，分析过程快速、简单、稳定、安全;QuEChERS提取液可直接用于UPLC/MS/MS分析，而不用进一步净化;简洁的Oasis MCX固相萃取流程为低ppb检测限的多菌灵UV检测提供了有效的样品净化和富集方法;Oasis MCX固相萃取净化能够增强UPLC/MS/MS的分析性能，即使这一步骤并非必需过程;经固相萃取净化后的橙汁样品中的多菌灵，其LC/UV与UPLC/MS/MS分析结果达到一致。